在细胞中构建一条全新的泛素化途径来研究泛素E3 UBE4B的底物特异性

In eukaryotes, the Ubiquitin-Proteasome system is responsible for the degradation of most proteins. Ubiquitin (Ub) is a highly conserved 76-amino-acid polypeptide that is covalently attached to substrate proteins through an enzymatic cascade composed of three classes of enzymes termed activating enzyme (E1), conjugating enzyme (E2) and Ub ligase (E3). Although the biochemical mechanisms of Ub transfer through the E1-E2-E3 cascade have been well established, it is still difficult to study the interactions between E2 and E3 as well E3 and their substrate proteins due to the cross reactivities among them. To untangle the complexity of protein ubiquitination networks, we have used phage display technology to construct an Orthogonal Ubiquitin Transfer (OUT) pathway based on engineered Ub, E1, E2 and E3 enzymes (xUb, xE1, xE2 and xE3). Through the OUT cascade, an affinity-tagged Ub mutant (xUb) is activated and transferred to the substrate proteins of a specific E3 in order to elucidate the cellular targets of individual E3 enzymes. We previously finished the first two steps and published the results in Chemistry & Biology and Nature Communications. Currently we are working on the final step of the E3 ligase UBE4B and want to apply for the grant to complete the whole OUT pathway.

泛素-蛋白酶体系统是细胞中蛋白质降解的主要途径。泛素通过E1-E2-E3的级联反应传递到蛋白质表面，泛素化的蛋白质随后被系统降解。泛素E3是整个泛素化途径的关键酶，可以识别细胞中数万种底物蛋白。然而，不同的E3识别哪些底物，即E3的底物特异性，是泛素领域的一个难题。由于E3和底物之间复杂的交叉作用，很难通过基因敲除或RNA干扰等传统方法来研究这个问题。为了解决这一难题，我们提出了一个创造性的办法：在细胞中构建一条全新的、全部由突变体构成的泛素化途径。该条途径不和细胞内已有的任何野生型泛素化途径有交叉作用。构建这条途径共分成三步，目前，前两步已经完成，结果发表在Cell杂志子刊Chemistry and Biology和Nature杂志子刊Nature Communications上。现欲申请面上基金资助完成该途径的最后一步：即xE3的构建，进而发现并确定所选E3即UBE4B的底物。

泛素化是真核细胞中一种非常重要的蛋白质翻译后修饰，通过E1-E2-E3的酶联传递，泛素分子共价结合到底物蛋白并形成多聚泛素链或单泛素化，在蛋白质降解、信号传导、内吞、细胞周期调控等方面发挥重要作用。其中，泛素E3连接酶是最关键的因素，这是因为E3具有底物识别性，可以决定哪些底物需要被泛素化。然而，寻找和确定特定E3的底物并不容易，这是因为细胞中存在600多个泛素E3连接酶，不同E3可以作用在同一个底物，具有代偿功能，因此通过传统的基因敲除E3等方法很难确定一个特定E3的胞内底物。.在该项目中，我们在HEK293细胞中通过基因工程手段构建了一条全新的泛素传递链，用于发现泛素E3连接酶E4B在细胞中的底物。这条传递链中，泛素（Ub）带了一段标签，用于和细胞中野生型Ub区分。通过基因工程化泛素链传递及质谱序列分析，我们发现了超过100个蛋白可能是E4B的泛素化底物，该结果合作发表在Science Advances上。随后，我们对这100多个潜在的底物蛋白进行了体外泛素化和不同细胞模型中的泛素化鉴定，证明了其中一些蛋白可以明显被E4B泛素化及降解。通过调控E4B的表达量，可在细胞中调控其底物的降解，特别是一些与肿瘤生成相关的蛋白的降解。例如，我们证明了E4B可以降解TRA2A 和PYCR2，两种在肝癌中过表达并与癌症有关的蛋白，并且通过降解TRA2A进一步影响了细胞中前体mRNA的剪切功能（文章修回中）。我们证明了E4B可以通过在VPS35表面形成K48-和K11-泛素链进而降解VPS35，而这种降解影响了 VPS35向细胞质膜上运输beta肾上腺素受体的能力（投稿中）。这些结果为后续深入开展以E4B为靶标的药物分子筛选及底物的泛素化降解机制奠定了较好的理论支持。.在基金的支持下，以通讯和共同通讯作者身份在Cell Chemical Biology，Pharmacological Reviews，International Journal of Molecular Sciences，Frontiers in Pharmacology等杂志发表论文16篇，已授权专利一项，3项专利正在申请中。另有四篇SCI 论文正在投稿中。围绕基金内容，培养了四名硕士毕业生。