亮氨酸激活大菱鲆TOR信号通路的分子机制研究

The target of rapamycin (TOR) signaling pathway is a master regulator of cell anabolism and growth. Our preliminary data indicated that leucine could activate TOR pathway in turbot (Scophthalmus maximus L.), so did its metabolites α-ketoisocaproic acid (α-KIC) and β-hydroxy-β-methylbutyrate (HMB). However, the molecular mechanism of TOR pathway activation by leucine or its metabolites is still unclear. Using feeding experiment, our project will be conducted to illustrate the underlying mechanism of TOR pathway activation by leucine and its metabolites, and investigate the effects of leucine and its metabolites on amino acid sensing pathway upstream of TOR (leucine transporters and sensor), and downstream intermediary metabolism-related key enzymes in turbot. In addition, using muscle cell model, combined with molecular biological techniques of siRNA knock-down and gene over-expression, we will further investigate the regulation mechanisms of leucine transporter LAT1 and sensor Sestrin2 on TOR signaling pathway response, and consequently illustrate that amino acid sensing pathway is necessary for TORC1 activation by leucine. This study is not only the key guidance for the exploration of protein metabolism, but also provides the theoretical basis for the exploitation of new functional feed additives in fish.

雷帕霉素靶（TOR）信号通路是细胞合成代谢和生长最重要的调节中枢。申请人前期使用大菱鲆肌肉细胞研究发现，亮氨酸能够激活TOR信号通路；且亮氨酸的代谢物α-酮基异丁酸（α-KIC）和β-羟基-β-丁酸甲酯（HMB）也有类似功能。然而，亮氨酸及其代谢物激活大菱鲆TOR信号通路的分子机制均未知。本项目以大菱鲆为研究对象，通过摄食生长实验，研究亮氨酸及其代谢物激活TOR通路的潜在分子机制及差异，探讨了对TOR通路上游亮氨酸感知途径（亮氨酸转运载体和识别蛋白）及下游营养代谢途径关键分子表达的影响。使用大菱鲆肌肉细胞模型，结合基因沉默、过表达等分子生物学技术，进一步研究亮氨酸转运载体LAT1和识别蛋白Sestrin2对TOR信号通路的调节机制，以阐明亮氨酸感知途径是亮氨酸激活TOR通路的必需分子途径。该项目的实施对指导鱼类蛋白质代谢研究具有重要意义，也可为鱼类功能性饲料添加剂的开发提供理论依据。

无论鱼类还是哺乳动物，骨骼肌占身体的比重超过40%，肌肉的生成对动物的生长起决定作用。特别是鱼类，尤其肉食性鱼类的显著营养学特点是需要高达40%-60%的饲料蛋白质。因此蛋白质的利用对鱼类的生长和健康极其重要。研究表明，单一亮氨酸（Leu）与完全氨基酸混合物比，可同种程度的促进肌肉蛋白质合成，可见其重要的调节作用，而该机制在鱼类研究中却几乎空白，仅停留在对鱼类表观性状和饲料利用效率的探讨。. 本项目选取具有重要经济价值的海水养殖肉食性鱼类大菱鲆为研究对象，采用摄食生长实验研究了Leu及其代谢物α-酮异己酸钠（α-KIC）或β-羟基-β-丁酸甲酯钙（HMB）对大菱鲆生长性能、肌肉支链氨基酸含量，肠道功能、亮氨酸感知和应答的影响；研究中发现，与大鼠一致，鱼类肌肉中Leu感知蛋白Sestrin1的表达量极显著的高于Sestrin2和Sestrin3，因此为了研究便利，实验以大鼠模型，研究了Sestrins家族蛋白（Sesrin1、2和3）在肌肉以及其它组织的表达差异，并深入探究肌肉中Leu激活mTORC1信号通路的作用机制。. 结果表明，与基础对照组比，饲料中添加Leu或其代谢物均可显著提高鱼类生长性能；Leu或HMB可显著提高肠绒毛高度，且降低肠道Notch基因表达量，推测可减少上皮细胞分化，更多的促进增值，改善肠道功能；大菱鲆肌肉游离支链氨基酸（BCAA）含量受饲料Leu调节，不受Leu代谢物影响，而肌肉中结合型BCAA不受二者影响；Leu或HMB可显著降低肌肉中Leu感知蛋白Sestrin1表达量，对Sestrin2表达量影响不显著，显著抑制GCN2和4E-BP1的表达量，从而促进Leu感知，降低合成代谢的抑制作用；以大鼠为模型研究体内Leu感知机制，首次发现肌肉中Sestrin1为最重要的Leu感知蛋白，Leu对mTORC1的激活主要通过促进Sestrin1与GATOR2的解离来实现。. 对Leu激活mTORC1 通路的机制的研究，对于指导鱼类蛋白质代谢机理研究有重要的理论价值，有助于更好的通过营养学途径调控鱼类蛋白质合成代谢和生长性能；对于Leu代谢物分子机制的研究，能够为环境友好的功能性饲料添加剂的研发提供理论依据。.