TOR信号通路介导亮氨酸调控鸽乳蛋白合成的分子机制

Both male and female pigeons (Columba livia) possess the ability to produce a complete nutrient substance, termed crop milk, for the nourishment of their young. Crop milk protein, as the main nutrient content of crop milk, plays an important role for growth and development of the pigeon squab as it contains essential amino acids and biological active substances. Recent studies found that leucine can mediate milk protein synthesis via regulation of the target of rapamycin (TOR) signaling pathway. However, little is known about the effects and molecular mechanisms of leucine on TOR signaling pathway and crop milk protein synthesis. Firstly, the project was designed to determine the physiological structure changes of pigeon crop during the crop milk synthesis, and the content and compositions of crop milk protein. In order to determine the diverse proteins involved in TOR signaling pathway during crop milk synthesis, isobaric tag for relative and absolute quantification (iTRAQ) technique will be used to analyze the proteome in crop tissues. Base on the above experiments, pigeon crop epithelial cells and the incubation period of pigeon will be used as in vitro and in vivo model, respectively, to study the effects of leucine on crop physiological structure, crop milk synthesis, and the expression of key proteins of TOR singling pathway, and then to illustrate the molecular mechanism under leucine regulates crop milk synthesis. This study will provide a theoretical basis for regulation of crop milk protein by seeking the targets of molecules on TOR signaling pathway.

鸽乳由双亲种鸽嗉囊上皮细胞分泌，其产生完全不同于乳腺分泌乳汁的过程。乳蛋白是鸽乳的主要成分，富含各种氨基酸和生物活性物质，对乳鸽的生长发育至关重要。雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin, TOR）是哺乳动物乳蛋白合成的主要途径，亮氨酸可通过TOR信号通路显著正调控哺乳动物乳蛋白的合成，但对于TOR信号通路是否参与鸽乳蛋白的合成及亮氨酸对其的调控作用却知之甚少。本项目以种鸽嗉囊为研究对象，通过分析不同繁殖周期种鸽嗉囊的生理结构和鸽乳蛋白合成规律，并基于iTRAQ蛋白质组学分析筛查TOR基因网络中参与鸽乳蛋白合成的关键分子，筛选调控靶点。在此基础上通过种鸽嗉囊上皮细胞模型和在体试验，研究亮氨酸对TOR信号通路和鸽乳蛋白合成的影响，并结合雏鸽生长情况，从机体、组织和细胞三个水平深入探讨TOR信号通路介导亮氨酸调控鸽乳蛋白合成的分子机制，进而为鸽乳蛋白的合成调控提供理论基础。

鸽乳为乳鸽的主要营养物质来源，但其营养成分含量及其合成过程与哺乳动物存在较大差异。雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin, TOR）是哺乳动物乳蛋白合成的主要途径，但其是否参与鸽乳蛋白质的合成及亮氨酸对其的调控作用尚不清楚。项目研究了不同繁殖周期种鸽嗉囊生理结构、鸽乳成分和血清中激素含量变化规律；探究了乳鸽生长发育及肠道氨基酸转运载体基因表达规律；测定了种鸽对日粮粗蛋白质的需要量；采用iTRAQ蛋白质组学技术，分析了不同繁殖周期种鸽嗉囊组织中的蛋白质表达差异，并采用Western Blot进行了验证；研究了TOR信号通路特异抑制剂雷帕霉素对种鸽乳蛋白质合成和乳鸽生长的影响；研究了亮氨酸对种鸽嗉囊组织发育、乳蛋白合成和乳鸽生长的影响，并探究了TOR 信号通路介导亮氨酸调控鸽乳蛋白合成的分子机制。结果表明：（1）与休产期相比，哺育期种鸽血清中催乳素和胰岛素含量及嗉囊组织厚度和重量均显著增加；鸽乳中粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分分别占56.7%、31.21%和9.8%；（2）在“2＋4”饲养模式下，种鸽日粮适宜的粗蛋白质水平为18%。（3）乳鸽的生长曲线符合Gompertz模型[Y=507.717×e-3.756exp(-0.167t)，Y为活重，t为日龄，R2=0.9997]；建议乳鸽28日龄前上市；（4）乳鸽肠道营养素转运载体PepT1和NHE2 mRNA表达丰度与乳鸽肠道重量和半净膛重呈正相关关系；（5）采用iTRAQ蛋白质组学在种鸽嗉囊组织中鉴定到4926个蛋白，其中差异蛋白575个，涉及Akt-TOR、FAK、MAPK和Caspase等信号通路；Western Blotting验证结果表明，哺育期种鸽嗉囊组织中Akt-TOR信号通路蛋白表达均显著上调；（6）在体注射TOR信号通路特异抑制剂（雷帕霉素）可显著抑制种鸽嗉囊组织中TOR信号通路，降低乳蛋白质合成和乳鸽生长。（7）日粮（CP=16.0%）添加0.45%亮氨酸可显著增加乳鸽的生长性能和屠宰性能，提高种鸽嗉囊组织TOR、S6K、S6、4EBP1和eIF4E蛋白的表达，表明TOR 信号通路介导亮氨酸调控鸽乳蛋白合成；建议种鸽日粮（CP=16.0%）中亮氨酸的最适宜添加水平为0.45%。综上，项目的实施可为生产上进一步优化种鸽日粮营养配方，进而提高鸽乳蛋白质合成和改善乳鸽生长提供基础数据和理论依据。