IL-1β通过NF-κB/Lipocalin2调控大肠癌上皮间质转化的机制研究

Metastasis is the main cause of death in patients with colorectal cancer. Epithelial mesenchymal transition (EMT), which is the important mechanism in metastasis, involves a variety of molecules and signaling pathways. Inflammatory cytokines IL-1β, mainly produced by monocytes, macrophages and endothelial cells, can upregulate the expression of lipocalin2(LCN2) by active NF-κB. In previous study, our group found that IL-1βactivated NF-κB , inhibited the expression of E-cadherin, and upregulated the expression of Snail and LCN2. Moreover, the results showed that NF-κB promoted EMT, and LCN2 inhibited EMT. In this study, we will clarify whether IL-1β can induce EMT by the activation of NF-κB, and whether the upregulation of LCN2 can inhibit EMT induced by IL-1β/NF-κB pathway. The experimental methods include in vitro experiments in cell lines, in vivo animal experiments, and detection in tissue samples. It will provide a theory model on the relation between tumor inflammatory microenvironment and metastasis.

转移是大肠癌患者死亡的最主要原因，上皮间质转化（EMT）是转移发生的重要机制，涉及多种分子和信号通路。炎症因子IL-1β主要是由单核巨噬细胞或内皮细胞分泌产生，可以通过激活肿瘤细胞内的NF-κB上调Lipocalin2（LCN2）的表达。前期实验结果初步发现在大肠癌中，IL-1β可以激活NF-κB、抑制E-cadherin表达、上调Snail，还能促进LCN2表达；NF-κB可以促进EMT，LCN2却抑制EMT。因此本课题拟通过体外细胞系实验、体内动物实验及人体组织样本检测，明确IL-1β是否可以通过激活NF-κB来促进EMT，其上调的LCN2是否能抑制IL-1β/NF-κB引起的EMT，形成负反馈性调控。从而为阐明炎症微环境与肿瘤转移之间的调控机制提供新思路。

我们的课题原定是用IL-1β刺激建立细胞模型，在进行过程中将其前延，改为用LPS刺激建立细胞模型。研究结果如下。.我们在结肠癌细胞系DLD1和RKO中用1μg/mlLPS处理24小时，可以明显诱导细胞炎症小体的活化。Transwell迁移和侵袭实验表明，LPS可以明显促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，此作用可以被Caspase1抑制剂Ac-YVAD-CHO抑制，提示LPS通过诱导炎症小体活化以促进细胞的迁移和侵袭。.同时，LPS可以明显上调磷酸化P65的表达及入核，小干扰RNA敲降P65后LPS不再发挥其活化炎症小体的效应，表明LPS通过调控NF-kB/P65活化以促进炎症小体的活化。.进一步发现LPS可以明显上调Snail蛋白表达量并促进其入核；而当敲降P65之后，LPS不再发挥其上调Snail表达并促进Snail入核的作用，这表明NF-kB/P65在LPS调控Snail表达过程中发挥重要作用。当敲降Snail之后，LPS不再促进侵袭与迁移。这说明，Snail在LPS促进细胞迁移和侵袭过程中发挥重要作用。.以不同葡萄糖浓度（0、5、10、15mM）培养细胞并进行细胞迁移与侵袭实验，发现在无糖（0mM）培养条件下，LPS对结直肠癌RKO和DLD1细胞系的运动能力无影响，而在葡萄糖浓度为5、10、15mM的细胞培养条件下，LPS可以明显增强细胞的运动能力。并且LPS可以明显促进细胞的葡萄糖消耗以及乳酸产生；当敲降Snail之后，LPS不再影响细胞糖酵解水平。.LPS对HK1、HK2、PFKP、PKM2这4种糖酵解限速酶的表达无明显影响，却明显上调HK3的表达。在抑制NF-kB/P65入核或敲降Snail表达之后，LPS不再发挥其上调HK3表达的作用。我们构建了含HK3启动子区段的荧光素酶报告基因载体，结果表明，LPS可上调HK3启动子活性，抑制NF-kB/P65入核或敲降Snail表达之后，LPS不再上调HK3启动子活性。同时，免疫共沉淀结果发现LPS可以促进NF-kB/P65与Snail形成蛋白复合体，细胞免疫荧光结果发现此蛋白复合体定位在细胞核内。.利用实验室已有的78例结直肠癌组织cDNA样本，检测各基因的RNA表达水平，结果表明Caspase1与P65，NF-kB/P65与Snail，NF-kB/P65与HK3，Snail与HK3表达均呈明显正相关。.因此我们认为