裂殖酵母钙调神经磷酸酶基因缺失株表型抑制基因的筛选鉴定及作用机制的研究

裂殖酵母被认为是研究真核生物的理想模式生物，广泛应用于细胞周期、细胞生长及形态的调控、细胞凋亡、细胞内信号转导等多种机制的研究。钙调神经磷酸酶是钙信号从细胞膜向细胞核传递过程中一个极其重要的信号转导分子，参与调节多种生理功能，与Pmk1 MAPK 信号转导相互拮抗调节氯离子稳态。筛选、鉴定裂殖酵母钙调神经磷酸酶基因缺失株的表型抑制基因是研究钙调神经磷酸酶分子调控机制的重要研究手段。本课题组在新发现两个裂殖酵母钙调神经磷酸酶基因缺失株的表型抑制基因SPAC1705.03c和SPBC1E8.05的基础上，拟通过构建此二基因缺失株，鉴定其表现型，解析其编码蛋白细胞内功能定位，深入研究此二基因与Pmk1 MAPK信号转导途径相关因子间的作用机制，寻找此二基因的作用位点，为进一步解析钙调神经磷酸酶及Pmk1 MAPK 信号转导途径的调控机制，提供新的信息和依据，也为抗真菌治疗提供新靶点。

裂殖酵母被认为是研究真核生物的理想模式生物，广泛应用于细胞周期、细胞生长及形态的调控、细胞凋亡、细胞内信号转导等多种机制的研究。钙调神经磷酸酶是钙信号从细胞膜向细胞核传递过程中一个极其重要的信号转导分子，参与调节多种生理功能。为深入解析钙调神经磷酸酶的作用机制，本课题组筛选鉴定出两种编码糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白（GPI-anchored protein）的基因——SPBC1E8.05（gaz2）和SPAC1705.03（ecm33）为钙调神经磷酸酶基因缺失株的表型抑制基因，并发现，这两种基因也是锌转运体Cis4基因突变株的表型抑制基因。以往研究表明，Cis4属阳离子转运促进因子蛋白家族，主要通过调节锌稳态，参与调节高尔基体膜运输功能。在本项目执行过程中，我们又发现另一编码GPI anchor蛋白的aah3高度表达也能矫正cis4基因突变株的表型，是cis4基因突变株的表型抑制基因；通过构建gaz2、ecm33及aah3基因缺失株，比较其表型的差异并分析了三种基因之间的相关性，结果显示三种基因编码蛋白结构虽不同，但具有部分功能相关性；通过构建cis4its8双基因突变株，验证其表型，发现cis4和its8基因具有遗传学的基因相关性；为进一步研究ecm33和gaz2基因功能，利用site directed mutagenesis方法构建一系列部分碱基缺失质粒，并检验了部分碱基缺失对于其基因功能的影响；为深入研究Ecm33的细胞内功能定位，成功构建GFP-Ecm33质粒，应用荧光显微镜进行了细胞内定位研究。结果发现，在野生细胞株内GFP-Ecm33定位于细胞膜两端及分裂中隔，而在编码参与GPI anchor合成的its8基因的突变株内则定位于细胞膜及内质网上；另外，在正常培养条件下，Cis4基因缺失株内的GFP-Ecm33细胞定位虽然没有改变，但当低锌的环境下则主要位于内质网及点状聚集；尤其GFP-Ecm33在高尔基体膜运输功能相关基因——apm1、ypt3及chc1的基因突变株内则主要定位于高尔基体，表明GFP-Ecm33在这些细胞株内未能被正常转运至细胞膜而停留于高尔基体内。综上结果表明，裂殖酵母中GPI anchor蛋白主要是通过clathrin介导的后高尔基体膜转运系统运输，而锌转运体Cis4在GPI anchor蛋白的运输过程中也发挥着重要作用。