裂殖酵母锌转运体Cis4基因突变株的表型抑制基因筛选、鉴定及作用机制研究

裂殖酵母是研究真核生物的理想模式生物，广泛应用于细胞周期、细胞生长及形态的调控及细胞内信号转导等多种机制的研究。锌是机体必需的微量元素，通过锌转运体介导调控细胞内锌稳态。Cis4是笔者新近发现的锌转运体，属阳离子转运促进因子（CDF）蛋白家族，与另一CDF蛋白家族成员Zrg17形成异构复合体，通过调节锌稳态，参与调节高尔基体膜运输功能。筛选、鉴定基因突变株的表型抑制基因是研究基因功能的重要研究手段。本课题组在初步筛选出两个cis4-1基因突变株表型抑制基因- - ubi1和ubc4的基础上，应用分子生物学等方法鉴定参与调控锌转运体Cis4功能的泛素连接酶及参与Cis4功能调节的泛素化修饰类型和作用点，解析核糖体-泛素融合蛋白Ubi1和泛素聚集酶Ubc4参与锌转运体Cis4介导的细胞内高尔基体膜运输功能的分子调控机制，为进一步解析哺乳动物细胞锌转运体乃至锌稳态的调控机制提供新的线索和依据。

裂殖酵母被认为是研究真核生物的理想模式生物，广泛应用于细胞周期、细胞生长及形态的调控、细胞凋亡、细胞内信号转导等多种机制的研究。以往研究发现，Cis4是属阳离子转运促进因子蛋白家族的锌转运体，通过调控锌稳态进而参与调节高尔基体膜运输功能。本课题组筛选鉴定出两个泛素化相关基因——ubi1和ubc4为cis4-1基因突变株表型抑制基因，并发现，这两种基因也是ecm33基因缺失株的表型抑制基因。Ecm33基因编码糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-anchored protein)。本课题组通过构建系列ubi1点突变质粒，检验了其对cis4和ecm33基因缺失株表型的影响。结果发现，表达Ubi1K63R仅能部分矫正这两种基因缺失株的表型，说明63号赖氨酸介导的泛素化修饰过程参与调节此功能。Pub1，pub2，pub3编码泛素连接酶。分别构建pub1cis4，pub2cis4，pub3cis4双基因缺失株，验证其表型，发现cis4与pub1具有遗传学的基因相关性，ubi1和ubc4过量表达不能矫正pub1cis4双基因缺失株的表型。深入研究pub1功能，发现pub1基因缺失株具有一系列表型。培养基中添加山梨醇可矫正除了ZnSO4和LiCl2敏感性以外的所有表型。pub1基因缺失株中CDRE活性和Ecm33活性明显增高。应用荧光显微镜进行了GFP-Ecm33蛋白在细胞中的定位研究。结果显示，GFP-Ecm33在对数生长期的野生细胞株中定位于细胞表面及中隔，在后对数生长期定位于细胞膜以及高尔基体，在细胞生长平台期则仅定位于高尔基体；pub1基因缺失株和ubc4基因突变株中，GFP-Ecm33在各个细胞生长期中均定位于细胞膜。构建pub1apm1双基因缺失株，检验其表型，发现pub1与apm1亦具有遗传学的基因相关性。过量表达ubi1和ubc4能矫正apm1基因缺失株的表型，但不能矫正pub1apm1双基因缺失株的表型。检验另一编码GPI anchor蛋白的Gaz2细胞内定位，发现在pub1基因缺失株中，GFP-Gaz2也显示与GFP-Ecm33同样的异常定位。通过pull-down assay实验，发现Ecm33并未被直接泛素化。综上结果表明，泛素连接酶Pub1参与调节细胞壁完整性；ubi1-ubc4-pub1介导的泛素化修饰参与调控GPI anchor蛋白Ecm33的内吞作用。