恶性疟原虫抗哌喹株耐药相关基因的筛选及鉴定

恶性疟原虫（P.f.）对几乎所有抗疟药均产生抗性的问题是疟防领域亟待解决的重要课题。P.f.抗性的产生与虫体某些关键基因的遗传变异有关。氯喹等多种抗疟药的抗性相关基因及其频发突变位点已基本明确。而作为氯喹替代药物的哌喹（PQ）抗疟及耐药机制不明；是否存在耐药相关标志基因尚待研究。PQ由我国自主研发，具有效安全、低毒价廉、半衰期长的特点，单独使用出现抗性后现与青蒿素类药物配伍是一线药，被称为"复活的抗疟药"引起关注。本项目拟从P.f.红内期体外培养入手，通过PQ剂量递增诱导虫体产生耐药性，建立P.f.PQ敏感株及抗性株的体外模型；继而应用代表性差异显示技术，在基因组DNA和cDNA水平分别构建PQ敏感/抗性差减文库；克隆筛选、基因测序、数据库比对鉴定、生物信息功能预测，以期获得P.f.PQ抗性相关基因，为深入探讨PQ的抗疟及耐药机制、现场抗性监测、新药靶向、免疫靶标等研究提供理论及实验依据。

恶性疟原虫对现有的抗疟药几乎都产生了抗药性，疟原虫的抗性问题是疟疾防治的极大障碍。抗性的产生与疟原虫特定基因（抗性相关基因）的变异有关。磷酸哌喹是我国自主研发的疟疾预防及治疗配伍一线药物，但其抗疟及抗性机制有待阐明，对其抗性相关基因的筛选，是主要的研究目的。本课题建立了伯氏疟原虫哌喹抗性系，利用该模型从疟原虫哌喹抗性相关生物学特征、免疫学特征及抗性相关基因的筛选几个方面进行了研究，结果发现，疟原虫对哌喹产生抗性后，红内期虫体毒力显著减弱，感染小鼠原虫率降低、贫血程度明显减轻，生存时间显著延长甚至可清除虫体；抗性系接种小鼠可抵抗致死性敏感系的攻击感染。敏感系与抗性系感染鼠脾细胞分泌的IFN-、IL-4及TNF-随接种时间呈动态变化，其表达量与原虫率的高低有一定关系；组织学观察抗性组炎性反应较轻；分别建立了伯氏疟原虫哌喹抗性系及敏感系感染小鼠脾脏和虫体基因组差减文库，通过代表性差异分析，脾脏差异基因筛选所得96个差减克隆片段中，有24个是免疫相关基因及T细胞受体相关基因；虫体基因组差减文库筛选初步锁定了7个功能未明基因序列及伯氏疟原虫ANKA株热休克蛋白40基因序列（Plasmodium berghei strain ANKA heat shock 40 kDa protein，HSP40）；所获得的抗性相关候选基因片段，为进一步探讨其在哌喹抗性相关分子机制中的作用奠定了实验基础。该课题完成了预期研究目标。