化学-酶法联用构建结构确定的双特异性免疫探针

Due to the strong affinity and high specificity for its target, monoclonal antibody can be used for early cancer detection and diagnosis through targeting the corresponding cancer biomarkers. The use of bispecific antibodies targeting multiple cancerous molecular pathway of cancer has great potential for early detection and diagnosis of small malignant lesion. Chemical modification of protein is a useful tool for rapid, facile and efficient preparation of various antibody derivatives. However, current chemical modification methods lacking of site-specificity show low conjugation efficiency, and most importantly, cannot provide structurally defined products. Due to the fast kinetics, high site-selectivity, and good compatibility under physiological conditions, bioorthogonal reactions and enzyme-mediated ligations have been successfully applied to site-specific modification of proteins in recent years. Herein, based on the incorporation of unnatural amino acids, we aim to develop a novel chemoenzymatic method for rapid and facile preparation of structurally defined antibody derivatives. It is hoped that this method can be used for constructing dual-antigen targeting immunoprobes, which may ultimately lead to better diagnosis sensitivity and early detection and diagnosis of small malignant lesions.

单克隆抗体由于其良好的抗原特异性和亲和性，可通过靶向相关的肿瘤标志物在分子水平上实现早期癌变的可视化。双特异性抗体同时与肿瘤细胞表面多个受体或抗原结合，能在分子水平上提高检测的灵敏性和精准性，在肿瘤的早期诊断领域具有不可估量的发展潜力。通过化学修饰的手段直接构建抗体衍生物具有快速、简单、高效等优点，但是目前抗体的化学修饰方法存在诸多问题，如修饰位点不可控、偶联产率低、产物结构不确定等。近年来发展的生物正交反应和酶催化的连接方法具有反应速度快、位点选择性高、生理条件兼容性好等优点，已成功用于构建含有非天然成分的蛋白质分子。本项目拟在基于基因编码的非天然氨基酸嵌入的技术上，将转肽酶催化反应和“点击”生物正交反应这两种方法联用，发展一种简单、高效的构建结构确定的抗体衍生物的方法。我们希望该方法可以用于构建特异性肿瘤靶向的双靶点免疫探针，为恶性肿瘤的早期检测和诊断提供新的思路。

单克隆抗体由于其良好的抗原特异性和亲和性，能够有效靶向相关的肿瘤细胞表面抗原，对恶性肿瘤的诊断和治疗有很高的价值。通过化学修饰的手段直接构建抗体衍生物具有快速、简单、高效等优点，但是目前抗体的化学修饰方法存在诸多问题，如修饰位点不可控、偶联产率低、产物结构不确定等。近年来发展的生物正交反应和酶催化的连接方法具有反应速度快、位点选择性高、生理条件兼容性好等优点，已成功用于构建含有非天然成分的蛋白质分子。本项目我们发展一种能够快速、简单、高效的合成多靶向性抗体衍生物的通用方法，实现高亲和性、低脱靶效应的抗体偶联物的构建。我们主要从以下三方面开展研究：（1）抗MUC1的免疫探针的构建和肿瘤靶向活性研究：我们设计了一系列抗MUC1的免疫探针，从偶联方式、偶联位点和偶联化学等方面进行了研究；研究结果表明，连有聚乙二醇链接的抗体偶联物具有更高的细胞摄取率和更快的内化率方面；该优化方法能有效提高抗体的检测活性。（2）抗EGFR的抗体偶联物的溶酶体靶向和抗肿瘤活性研究：我们利用转肽反应对抗EGFR抗体的C端进行用溶酶体分选信号的融合和结构表征；并对所构建偶联物进行活性研究；结果表明，使用细胞穿膜肽和溶酶体分选肽的组合修饰能够提高抗体偶联物在肿瘤细胞表明的聚集和溶酶体的靶向性，并明显改善抗体偶联物在体外的抗肿瘤活性。（3）基于非天然氨基酸的生物正交反应的蛋白质荧光标记技术的开发：利用钯催化的生物正交反应对嵌有氟代磺酸酯-酪氨酸点绿色荧光蛋白进行化学修饰；开展基于氟代磺酸酯生物正交反应的蛋白质成像研究，通过该研究开发了一种基于氟代磺酸酯-酪氨酸生物正交反应的弱背景干扰的蛋白质荧光标记技术，该技术具有潜在的蛋白质原位荧光标记的应用前景。