从细胞凋亡与热休克途径解析高温胁迫抑制WSS发病的机理

由对虾白斑综合症病毒（WSSV）引起的对虾白斑综合症（WSS）以其传染性强、传播广、致死率高、防治难的特点成为严重危害我国对虾养殖业的重要病害。WSS的爆发具有明显的季节性，高温能不同程度地降低或减缓WSS的发生，但对其作用机理尚不清楚。本项目拟以克氏原螯虾为模式动物，应用共聚焦显微镜技术、透射电镜技术、扫描电镜技术、DNA片段化检测、荧光染色、免疫细胞化学及流式细胞术等现代分子生物学方法，从细胞超微结构的改变、胞内活性氧类物质O2-的变化、胞浆Ca2+浓度的变化、染色体DNA的损伤及Bcl-2/p53蛋白表达改变等方面集中研究高温胁迫诱导克氏原螯虾细胞凋亡的机理，并通过对HSP70 mRNA及蛋白水平的检测探讨克氏原螯虾在高温胁迫下可能存在的热休克反应，从而明确高温胁迫抑制WSSV在克氏原螯虾体内增殖的机制，为防治WSS提供新思路。

对虾白斑综合症（WSS）作为影响全球对虾养殖业发展最严重的病害之一，以其发病快、传播广的特点造成了巨大的经济损失，但是目前依然没有有效的防治措施。其爆发具有明显的季节性，高温能抑制其病原对虾白斑综合症病毒（WSSV）的增殖，从而不同程度地降低或减缓WSS 的发生，但作用机制尚不清楚。本项目从宿主层面出发，通过构建WSSV高温感染克氏原螯虾的模型，分别从细胞凋亡和热休克途径考察了高温抑制WSSV增殖的可能机制。在细胞凋亡方面，TUNEL原位杂交结果表明，高温能明显增强在感染螯虾肝胰腺和腮组织中的凋亡信号，在鳃组织中平均凋亡指数比常温感染组高40.6％。透射电子显微镜观察发现在感染晚期，高温感染组出现大量凋亡小体，而常温感染组却只观察到许多WSSV颗粒。流式细胞仪检测发现高温感染组螯虾颗粒细胞的凋亡率最高达到13.6%，而常温感染组最高则为7.8%。Caspase-3的相对酶活高温感染组最高为3.5倍的，而常温感染组为2.6倍。RT-PCR技术检测WSSV的抗凋亡基因结果表明，抗凋亡基因ORF390和ORF222呈现出与病毒复制相似的表达规律，即随着WSSV感染进程，常温感染组中表达量不断增加，而高温感染组则是呈现先上升再降低的趋势。在热休克方面，对HSP70 mRNA 及蛋白水平的检测结果显示WSSV感染和高温条件都能使HSP70 mRNA及蛋白的表达量显著增加，高温感染组螯虾的表达量显著高于常温感染组的螯虾，而且存在组织特异性，在肌肉、鳃、肝胰腺等组织中的变化显著。这些结果都表明高温感染组的细胞凋亡率和热休克反应显著高于常温感染组，暗示着细胞凋亡和热休克反应在高温抑制WSSV复制过程发挥着相当重要的作用，为进一步防治WSS 提供了新思路。