钩端螺旋体sRNA的鉴定及其对毒力基因的调控机制

Leptospirosis, a zoonosis of worldwide distribution and recognized as an emerging natural focus infectious diseases, is caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira, and serious harm to public health security and the development of animal husbandry. To solve the problem that virulence genes and its regulation are not yet clear hinder prevention and treatment of the disease, we choice small non-coding RNA (sRNA) playing a key regulatory role in virulence genes expression in bacteria as a theory base, and use of next-generation sequence and molecular biology techniques to deep sequence and identify of these different of sRNA from leptospiral genome-wide transcriptional leve by comparing the Leptospira passage or not. To dig out these different sRNA targeting virulence genes, we will use computer to predict of these sRNA targeting virulence genes, and further will be confirmed by Northern blot et al molecular biology techniques and gene konckout et al genetics methods. These results will not only elucidate the regulation mechanism of sRNA on the expression of virulence genes, but also these virulence genes can be used as vaccine candidates, and provide a theoretical and experimental base for further prevent and treatment of this disease.

钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体（钩体）引起的一种全球性、自然疫源性、人兽共患传染病，严重危害了人类公共卫生安全和畜牧业的发展。本项目针对钩体的主要毒力基因及其调节机制不详导致该病防治困难这一难题，以细菌毒力基因表达受非编码小RNA（sRNA）分子调控为理论依据，应用新一代测序技术和分子生物学技术，从钩体的全基因组转录水平上,深度测序筛选出复壮前(毒力弱)、复壮后(毒力强)差异的sRNA，然后从已鉴定的差异sRNA入手，使用生物信息学软件进行预测，配合Northern blot等分子生物学以及基因敲除等遗传学方法，反向找出这些sRNA所调控的靶向毒力基因，不仅对阐明sRNA在钩体感染过程中对毒力基因表达的调控机制有重要意义，而且筛选出的毒力基因可以作为疫苗开发的靶标基因，为该病的防治奠定理论和实验基础。

钩端螺旋体病（钩体病）是由钩端螺旋体（钩体）引起的一种世界范围广泛存在的自然疫源性的人畜共患病。目前，钩体病的防治所面临的主要问题是致病机制不详导致其疫苗、诊断的研发受限而导致该病预防难和治疗不及时。本项目率先以参与病原菌基因调控的sRNA为切入点，通过对强毒力、中等毒力和无毒力3种不同毒力的钩体进行转录组测序和sRNA测序，发现其中一些被证实与毒力相关的基因如katE、hemO和htpG以及潜在的毒力基因sph1和sph2；与参与钩体侵袭和黏附相关的运动和趋化基因fliC、fliE、fliK、fliE、fliS、flgG、flgC；与宿主ECM互作的ligB和lipL32均呈现表达差异。此外，出现差异表达的基因主要集中在多种生化途径，涉及碳源代谢、脂类代谢、能量产生、多种化合物的结合以及抗氧化等，说明参与这些进程的基因中，有可能存在与毒力变化密切相关的基因，可能是使钩体毒力减弱的主要原因。而接下来，将对这些差异表达的基因通过基因敲除的方法对其功能进行分析，筛选有望作为疫苗和诊断候选基因的致病相关基因。此外，本研究首次对钩体的sRNA的伴侣蛋白Hfq进行了克隆、原核表达及蛋白纯化，并制备了Hfq的兔原多抗，Hfq作为一个转录后调节因子，可结合sRNAs使其稳定结合靶标mRNA，因此本研究利用测序并鉴定为sRNA的片段与纯化的伴侣蛋白hfq互作，钓取对应的靶mRNA，探讨其调控机制，从而为探讨钩体致病机制奠定基础；另一方面，针对动物钩体病缺乏针对性治疗的情况，选取本实验室已证实具有抗炎作用的中药单体大黄素、百里香酚和紫云英苷为抗炎药物，通过测定TNF-α、IL-1β和IL-6这3种促炎因子的表达情况，评价这3种中药单体对感染钩体的小鼠子宫组织炎症反应的抑制作用，发现这3种中药单体可通过抑制NF-κB和MAPKs两条信号通路的磷酸化降低促炎因子的表达，发挥抗炎作用。此外，在针对钩体的清除性治疗方面，以机体存活率，病原清除率以及组织损伤情况作为主要的评价指标，评价不同剂量的头孢吡肟、尔他培南和诺氟沙星的治疗效果。结果显示，头孢吡肟的3个治疗剂量均可显著提高感染钩体的金黄地鼠存活率，清除体内钩体并减轻组织损伤。对于动物钩体病的研究，实际上是从临床到实验室再回到临床的过程，本研究的目的就是希望将基础研究和临床有机的结合起来，从而为实现对动物钩体病更好、更为有效的防控奠定基础。