钩端螺旋体黄疸出血群有毒株和无毒株毒力进化机制探索

本项目以重要的病原微生物钩端螺旋体为研究对象。由于钩端螺旋体一直缺乏有效的体内遗传操作技术，其主要的致病因子和致病机制始终都没有阐明。在本课题组对钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株（有毒株）比较基因组学及蛋白质组学研究的基础上，以焦磷酸测序和定量蛋白质组技术为核心方法，快速而准确地对钩端螺旋体黄疸出血群无毒株IPAV（法赖）进行全基因组测序，通过比较分析黄疸出血群赖型赖株和法赖在基因组水平上的差异，并对两者在不同温度条件下蛋白质组以及外分泌蛋白表达差异进行大规模分析，找出钩体黄疸出血群特异的致病相关因子，探索赖型赖株和法赖基因组序列差异对两者不同温度蛋白质组以及外分泌蛋白表达差异的影响机制，确定导致赖型赖株和法赖毒力差异的分子基础和作用机理，进一步研究这些差异基因的功能和作用机理，将为详细阐明钩端螺旋体尤其是黄疸出血群的致病机制与毒力进化规律打下良好的基础。

03年和08年我们分别完成了问号钩体黄疸出血群赖型强毒赖株和无毒株法赖的全基因组测序。对赖型赖株和法赖前期比较基因组分析证实了虽然两株菌在毒力表型上差异明显，但基因组水平的差异却相当小。在进一步整合法赖和赖株在蛋白质水平差异信息的基础上，我们深入研究了几个最有可能与赖株和法赖毒力差异相关的基因，包括：1．翻译调节蛋白BipA在法赖的蛋白质表达水平上远远超过赖株。BipA蛋白与延伸因子EF-G序列相似具有结合70S核糖体的功能，过表达的BipA可能竞争性结合核糖体，从而阻止延伸因子的结合，扰乱正常的核糖体翻译功能。因此我们推测在法赖中BipA蛋白的过表达是对其蛋白翻译和核糖体合成负调控，BipA在法赖高水平表达可能在影响不同类别的蛋白质翻译水平发挥广泛作用。而且在基因组水平上，赖株BipA蛋白在N端三磷酸核苷水解酶结构域上有一个特异的赖株R66I突变。这个R66I突变可能是BipA在赖株中低水平而在无毒株法赖低水平表达的主要原因；2．Ser/Thr蛋白激酶（STPKs）一般是功能相关的激酶和磷酸酶位于一个操纵子中并共转录来调控途径中信号转导的活性。赖株和法赖STPKs包含激酶和磷酸酶结构域而同时具有激酶和磷酸酶活性。赖株基因组中一共包含3个STPKs拷贝，但只有LA_1422被检测出高表达。而其它两个没有检测出来。在基因组水平上，我们发现与赖株相比，法赖STPKs基因编码区存在单碱基缺失，导致移码突变并产生两个截短的新基因，分别包含激酶和磷酸酶结构域，其中包含激酶结构域的新基因是高表达的，而包含磷酸酶结构域的基因却没有检测到。而法赖STPKs另外两个拷贝是低程度地表达，因此可能是法赖3‘端磷酸酶的突变导致其不再表达，其调控功能也被抑制导致毒力差异；3. 在基因组水平上，与赖株相比，法赖的谷氨酰胺合成酶在第182位氨基酸有非同义突变导致了从疏水性Tyr到亲水性Cys的极性改变。以前研究发现，谷氨酰胺合成酶中Tyr功能是形成具有底物铵结合位点的口袋结构。我们推测法赖谷氨酰胺的合成能力受到抑制导致底物铵结合显著下降。而且在蛋白质水平上，谷氨酰胺合成酶在赖株表达量明显超过法赖。与之前研究报道的谷氨酰胺合成酶在钩体致病性血清型中高表达一致。对以上差异基因深入研究将有助于确定赖株和法赖毒力差异的分子基础和作用机理，为阐明钩体的致病机制与毒力进化规律打下良好的基础。