凡纳滨对虾肌苷酸代谢通路关键酶基因的克隆、表达及盐度调控机制

Litopenaeus vannamei is one of the most important aquatic shrimp species in China. However, as the high growth rate and yield of vannamei, its meat quality and flavor decreased dramatically, and severely restricted its price and sustainable development. This research uses the methods of biochemistry and molecular biology, focusing on one of the most important flavor substances -inosine monophosphate (IMP). Firstly,Using RT-PCR and RACE methods,cloning the key enzyme genes of IMP metabolic pathway, analyzing its sequence structure and function; Secondly, using real time PCR and Western blotting methods, detecting the key gene expressions in different tissues, different developmental stages at mRNA and protein level,respectively; Finally, set a six salinity gradients experiment, and by cultivation of shrimp, analyzing the IMP content, gene related enzyme activities, and the expression level of key genes. Illustrating the salinity regulation of IMP metabolism. Our data will provide a preliminary explanation for IMP metabolism of shrimp at molecular level, and may also supply useful information for quality improvement and molecular breeding of aquatic animals.

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国最主要的对虾养殖品种之一。然而在高生长速度、高产量的同时，其肉质风味却在急剧下降，并严重制约了其价格和可持续发展。本项目采用生化和分子生物学的方法，以凡纳滨对虾为研究对象，以影响肉质风味的重要鲜味物质-肌苷酸（IMP）为研究切入点，采用RT-PCR和RACE等技术，首先，克隆IMP代谢通路的关键酶基因，对其结构和功能进行解析；其次，采用real time PCR和Western blotting等技术，从mRNA和蛋白两个水平研究上述基因在虾体的组织分布，发育性表达，构建基因的时空表达谱；最后，设置6个盐度梯度，通过养殖试验，分析盐度对IMP含量，相关组织酶活，及关键酶基因表达的影响，初步阐明IMP代谢的盐度调控机制。以期在分子水平对凡纳滨对虾肌肉鲜味物质IMP的形成和变化规律给予初步解释，为从分子水平改进水产动物品质提供参考。

本项目针对内陆低盐或淡水养殖凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）品质劣化的关键科学问题，以肉质风味关键物质--肌苷酸（IMP）的形成和代谢机制为切入点开展研究。克隆得到IMP代谢通路的9个关键酶基因，首次克隆得到腺苷一磷酸脱氨酶2（AMPD2）、腺苷酸激酶（ADK）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、5'-核苷酸酶结构蛋白（Nt5dc3）等5个关键基因的cDNA全序列并提交Genbank数据库；同时克隆得到Na+-K+-ATP酶α亚基、Na+-K+-ATP酶β亚基、Ca2+-ATP酶、精氨酸激酶（AK）等4个关键基因的核心片段。对一些关键酶基因进行了结构分析和功能预测，鉴定了其保守结构域、酶活力催化位点、结合位点、以及磷酸化位点等关键功能区域，构建了Swiss-modle三维结构模型。对部分关键酶进行了多序列比对和进化树构建，获得了与其它物种的相似度，明确了关键酶类的进化地位，其中，AMPD2基因是首次在甲壳纲动物中克隆，并填补了AMP脱氨酶在甲壳动物进化上的缺失。项目查明了一些关键酶基因在凡纳滨对虾体内的组织分布情况，AMPD2和ADK基因在肝胰腺中表达量最高，其次是胃和肌肉；ACP基因在鳃和肝胰腺表达最高；ALP基因则在肝胰腺大量表达。本课题设计了高盐31‰、中盐16‰、低盐3‰三个盐度调控实验，结果表明，AMPD2基因在大部分组织中的表达与盐度变化呈正相关；ADK基因在肌肉和鳃中的基因表达与盐度变化呈正相关，而在肝胰腺和胃中则呈负相关；随着盐度下降，ALP和ACP基因则在大部分组织中呈现先下降后上升的趋势；ACP酶活在肌肉和胃中的变化趋势与盐度呈正相关；ALP酶活在肝胰腺、肌肉和肠道中与盐度变化呈正相关，而在胃和鳃组织中呈负相关。本项目利用高效液相色谱（HPLC）法测定了不同盐度下凡纳滨对虾肌肉IMP的含量，结果表明，低盐度组对虾肌肉IMP含量明显低于中、高盐度组，而中、高盐度组之间含量差异不明显。本项目研究的凡纳滨对虾IMP代谢通路关键酶基因、组织酶活与肌肉IMP含量之间的关系，使得从分子水平调控水产动物的风味成为可能，因为IMP的合成和分解代谢主要依赖于ATPase、ADK、AMP脱氨酶以及磷酸酶等的催化，并且IMP的积累很大程度上取决于上述关键酶类的数量和活力。