冷藏凡纳滨对虾腐败的关键调控机制之群体感应窃听研究

Bacterial quorum sensing (QS) has received much attention as a novel target for food preservation recently. Shewanella spp. is common specific spoilage organisms of refrigerated seafood, especially fish and shrimp. Our group previously found that Shewanella possesses a unique QS circuit, i.e. N-acyl-homoserine lactones (AHLs)-dependent eavesdropping. It is thus possible that QS eavesdropping plays an important role in the seafood spoilage. This program plans to study the role of QS eavesdropping in microbiota development and spoilage of refrigerated shrimp (Litopenaeus vannamei) by deletion of luxR in Shewanella and inoculation of sterilized peeled shrimp with the reconstituted initial microbiota. By using genomic and proteomic techniques, we will also investigate the regulatory roles of QS eavesdropping on growth, metabolism and spoilage potential of Shewanella. Disruption of AHLs-dependent QS eavesdropping in refrigerated shrimp by the AiiA protein purified from Bacillus will be studied, and its relationship with shelf-life of AiiA-treated shrimp will also be evaluated. This program systematically studies the micro-ecological role of QS eavesdropping in seafood for the first time, which would greatly enhance our understanding of seafood spoilage.

细菌群体感应（QS）是食品保鲜领域一种极具应用前景的新靶点。希瓦氏菌是冷藏鱼虾类海产品的特定腐败菌，本课题组前期研究发现，该菌具有窃听高丝氨酸内酯类信号分子（AHLs）的独特QS系统，由此我们推测，QS窃听可能对冷藏鱼虾类海产品腐败具有关键调控作用。本项目拟通过希瓦氏菌luxR基因（AHLs受体蛋白编码基因）敲除和初始菌相反接种实验，探究QS窃听在冷藏凡纳滨对虾腐败菌相演变和腐败进程中所起作用，再利用基因组学和蛋白质组学等技术手段，探究QS窃听对希瓦氏菌生长代谢和致腐能力的调控。此外，还将探析芽孢杆菌源AiiA蛋白对冷藏凡纳滨对虾的保鲜效果与其阻断AHLs介导的QS窃听之间的内在联系，阐明QS窃听对冷藏凡纳滨对虾腐败的调控机制。本课题首次较为系统地探索QS窃听在海洋食品微生态变化中的作用，有助于加深人们对鱼虾类海产品腐败机理的认识，还将为新型水产品保鲜技术的开发提供理论基础。

细菌群体感应(Quorum sensing, QS)是食品腐败变质调控的新靶点。本研究通过构建希瓦氏菌luxR基因缺陷株及回补株，探究QS窃听在冷藏凡纳滨对虾菌相演变和腐败进程中所起的作用及对希瓦氏菌生长代谢和致腐能力的调控。结果表明，依据PCR融合和基因重组原理，本研究成功构建了冷藏凡纳滨对虾特定腐败菌希瓦氏菌SA03的luxR2基因缺陷菌株(ΔluxR SA03)和回补株。希瓦氏菌SA03通过luxR2基因感受外源C6-HSL信号分子，进而通过QS系统提高其生长速率。luxR2基因与希瓦氏菌产硫能力有关，缺陷株产流能力显著下降，回补株又有所回升，野生型希瓦氏菌产硫能力明显高于luxR2缺陷型希瓦氏菌和回补株。.以含有野生型希瓦氏菌或luxR2缺陷型希瓦氏菌的初始菌相反接种凡纳滨对虾，结果表明，希瓦氏菌luxR2基因可以显著提高冷藏凡纳滨对虾贮藏过程中细菌的最大生长速率，缩短细菌生长延滞期。在培养144h后，luxR2缺陷型希瓦氏菌的细菌延滞期为88±4h，比野生型希瓦氏菌延长了138%，两者之间差异显著(P<0.05)。在凡纳滨对虾冷藏过程中，接种luxR2缺陷型希瓦氏菌后，凡纳滨对虾样品的细菌总数、TVB-N含量均显著低于野生型希瓦氏菌处理组(P<0.05)。贮藏第6 d，接种luxR2缺陷型希瓦氏菌的处理组的细菌总数和TVB-N值分别为81×105cfu/g和43.08±1.03mg/100g，分别比野生型希瓦氏菌处理组低38.7%和17.1%，差异达显著水平(P<0.05)。该结果表明希瓦氏菌LuxR系统介导的群体感应对其致腐能力影响显著。.利用蛋白质组学技术评价C4-HSL、C6-HSL和3-oxo-C6-HSL对Shewanella蛋白表达的影响，共有355个差异表达的蛋白，其中224个蛋白点表达上调，131个蛋白点表达下调。对差异表达倍数较高的蛋白点进行质谱分析，共有23个蛋白质被成功鉴定，以添加C6-HSL和3-oxo-C6-HSL的反应更为明显。.本研究还探析了阻断AHLs介导的QS窃听对腐败菌致腐能力的调控作用。以芽孢杆菌BF1基因组为模板，克隆了aiiA基因全长，构建pET-28a/aiiA重组质粒，重组菌经初步诱导，提取得到的AiiA粗酶液在活性平板上显示出了群体感应淬灭活性，酶活性为0.228 U/mL。