白念珠菌液泡钙通道Yvc1介导氧化压力应答的分子机制研究

Candida albicans is one of the most important opportunistic fungal pathogens. It is of significance to explore the mechanisms by which this pathogen responds to the host immune system. We recently found that the vacuolar calcium channel Yvc1 is a critical virulence-related factor, playing an essential role in oxidative stress response by mediating vacuolar calcium release. However, the molecular mechanisms of Yvc1-mediated oxidative stress response remains to be detailed. In this study, by detection of intracellular calcium levels, tagging of the indicative proteins, confocal microscopy, co-immunoprecipitation, mass spectrum analysis, C. albicans-host cell interaction assay, we will explore this molecular mechanisms, mainly focusing on the activation molecular mechanism of Yvc1 activation by oxidative stress, the mechanism by which Yvc1 activates the oxidative stress response pathway, the role of Yvc1 in protecting the mitochondrial functions, and the functions of Yvc1 and its effectors during the interaction between C. albicans and host. This study aims to uncover the detailed mechanisms of Yvc1-mediated oxidative stress response, and clarify the relationship between the calcium homeostasis system and oxidative stress response. The results may enrich the network of oxidative stress response in eukaryotic cells, shed new light on development of novel antifungal targets, and provide novel strategies in clinical treatment of C. albicans-related infections.

白念珠菌是临床极为重要的条件性致病真菌，探索其应答宿主免疫系统氧化压力的机制具有重要意义。申请人前期研究发现，该病原菌液泡钙通道Yvc1是极为重要的毒力相关因子，通过介导液泡钙释放，在氧化压力应答过程中扮演重要角色，但其介导氧化压力应答的分子机制尚未明确。本项目在前期研究基础上，通过胞质钙实时监测、标志蛋白荧光标记、共聚焦显微观察、免疫共沉淀、蛋白质谱检测、白念珠菌与宿主细胞互作分析等技术手段，从氧化压力对Yvc1的激活机制、Yvc1对氧化压力应答信号途径的激活机制、Yvc1对线粒体功能的保护作用和Yvc1及其效应因子在白念珠菌-宿主互作过程中的功能等方面，深入探讨Yvc1在白念珠菌氧化压力应答过程中的分子机制，阐明白念珠菌钙稳态系统与氧化压力应答的相互联系。本项目的实施，可丰富真核细胞的氧化压力应答网络，为发掘白念珠菌新型药物靶点提供新的理论依据，为临床治疗其感染提供新思路。

本项目重点关注白念珠菌液泡膜上的钙通道蛋白Yvc1，并系统研究了Yvc1蛋白参与氧化压力应答、内质网压力应答、极性生长与毒力等方面的重要功能。通过PCR介导的两步同源重组技术，成功构建了钙信号系统编码基因的缺失菌株，为后续基因的功能研究奠定了基础。通过氧化压力敏感性测定、抗氧化水平检测、液泡膜通透性测定、蛋白定位分析及RT-PCR等方法，发现白念珠菌液泡膜V-ATPase编码基因及YVC1的缺失均对氧化压力具有较强的敏感性，而且V-ATPase通过调控Yvc1蛋白的正常定位，从而通过Ca2+的释放来应对氧化压力胁迫的重要机制；通过HAC1剪切分析、线粒体活性及功能测定、Western-Blot降解的检测等手段，发现钙调神经磷酸酶CNB1缺失基础上敲除YVC1能够增强菌株在内质网压力下的生长能力，其机制在于YVC1的敲除减少液泡Ca2+的释放。通过顶体定位检测、肌动蛋白染色观察、菌丝ROS分布检测等技术，发现YVC1的缺失对菌丝发育具有抑制作用，Yvc1对菌丝发育具有调控作用，其机制在于通过影响中间介导蛋白NADPH氧化酶Fre8的定位，从而通过Ca2+的释放促进菌丝的极性生长。通过离子压力敏感性的检测、高铁还原酶活性的分析及ROS水平的检测，发现YVC1与CNB1的共同敲除造成了菌株对Fe3+的敏感性，其机制与胞质钙过载和氧化还原失衡密切相关。通过抗氧化水平的检测、SOD与CAT酶活的测定等方法，发现液泡-线粒体连接位点的重要蛋白VAM6参与氧化压力应答的机制在于对SOD1基因转录与表达水平上的调控。因此，本研究在白念珠菌中对Yvc1的功能进行了全面阐述，证实了该类蛋白在白念珠菌菌丝极性生长、内质网压力应答与氧化压力应答等方面的重要作用，为进一步认识钙通道相关调控蛋白奠定了工作基础，并且为新型抗真菌药物靶点的发掘及抗真菌药物的开发提供了理论依据和实践参考。