高等植物叶绿体异源从头合成辅酶Q10的研究

Coenzyme Q10, as the electron transmitter of the respiration chain and a native antioxidant in mitochondria, has important roles in energy supply and normal functions of human cells, being with broad applications and a huge market in the areas of medicine, healthcare, cosmetics and etc. Currently, it is mainly produced through the approaches of microbial (mostly as bacteria) metabolic engineering. Plant chloroplast, with many common features as bacterium, does not synthesize coenzyme Q, whereas it contains abundant related precursors (IPP and chorismate) and their corresponding biosynthetic pathways (MEP and Shikimate, respectively). In this project, we attempt to introduce artificially the pathway of bacterial coenzyme Q10 synthesis in tobacco chloroplasts by means of chloroplast transformation (or combined with nuclear transformation) and efficient strategies for multigene expression. De novo heterologous synthesis of high-level coenzyme Q10 in chloroplasts is to be expected, by making use of the large intrinsic availability of coenzyme Q precursors within chloroplasts. In this way, chloroplasts seem to be reverted to the photosynthetic bacteria rich in coenzyme Q10 production, and thus a new, efficient technique for producing coenzyme Q10 through plant metabolic genetic engineering is established. Moreover, the primary effects of synthesizing coenzyme Q10 in chloroplasts will be investigated by evaluating the performances of transgenic plants to resist the oxidative stress and other abiotic stresses as well as measuring the changes in the contents of endogenous target metabolites in chloroplasts. Meanwhile, the remnant degree of coenzyme Q biosynthesis pathway during chloroplast evolution will also get to be judged. Conclusively, this research is of considerable innovativeness and significance.

辅酶Q10作为线粒体呼吸链递氢体和天然抗氧化剂，对人体细胞能量供应和正常功能起着重要作用，在医药、保健和化妆品等领域有着广泛应用和巨大市场需求，目前大多通过微生物（主要为细菌）代谢工程生产。有着细菌共性的植物叶绿体不合成辅酶Q，但含有丰富的前体（IPP和分支酸）及其合成途径（MEP和莽草酸途径）。本课题拟通过叶绿体转化结合细胞核转化手段以及有效的多基因表达策略，人为向烟草叶绿体移植细菌辅酶Q10的合成途径，期望利用叶绿体固有的辅酶Q前体资源优势，异源从头并高水平地合成辅酶Q10，将叶绿体复原改造成富产辅酶Q10的光合细菌，从而建立一崭新且高效的植物代谢基因工程生产辅酶Q10的技术体系。另外，通过分析转基因植株的抗氧化胁迫能力和诸多逆境抗性以及叶绿体内源代谢物的含量变化，评判叶绿体合成辅酶Q10对植株的主要影响以及辅酶Q合成途径在叶绿体中的残存程度。总之，本课题具有显著的创新性和研究意义。

辅酶Q10（CoQ10）作为线粒体呼吸链必需组分和天然抗氧化剂，对细胞能量供应和正常功能起着重要作用，在医药、保健等领域有着广泛应用和巨大市场需求，目前大多通过细菌代谢工程生产。本项目研究内容主要是通过多基因表达策略向烟草叶绿体引入细菌CoQ10合成途径，利用叶绿体固有的辅酶Q 前体资源从头合成CoQ10，从而在植物平台上建立起新型代谢基因工程生产CoQ10的技术体系。取得的结果包括：（1）获得整合CoQ10合成核心途径（Q10core）的细胞核转基因烟草植株，其CoQ10含量较野生型植株提高了近2倍，并且其抗氧化能力也显著高于野生型烟草。该结果首次表明外源引入的细菌CoQ10合成途径能够完整转运并定位于叶绿体内发挥作用，从而驱动CoQ10在叶绿体内从头合成。（2）在工作（1）基础上进一步对辅酶Q前体IPP和分支酸的合成途径进行了强化，构建了一系列整合Q10core和辅酶Q前体强化合成途径的植物表达载体并获得一些含完整转基因的烟草植株。（3）在开展（2）工作同时建立一种新的植物大载体DNA组装方法，获得含32个转基因、近60 kb T-DNA大小、可进行农杆菌转化的植物超级载体pBI(Q10max)，该技术可适用于绝大多数植物（或其他物种如酵母、细菌）代谢基因工程研究所需的宏载体构建。（4）构建了整合Q10core的叶绿体表达载体，但没能获得其相应的烟草叶绿体转基因植株。当中可能原因、项目实施中其它一些问题和原因以及下一步的工作设想已给予说明。另外，在项目期间基于多方面考虑还开展了其它一些与本项目总体相关的工作并取得一定进展，包括：（5）鉴定了两种起增溶/热稳定作用的超酸性融合短肽。（6）建立了基于亚磷酸盐脱氢酶的植物磷利用/杂草控制/遗传转化体系，构建了该酶适合NADPH再生的突变体。（7）进行了其它一些抗逆酶/蛋白的功能分析，包括具有抗盐/抗旱作用的小桐子H+-PPase（JcVP1）和甲基戊糖梭菌Na+,H+-PPase（CmPP）以及具有抗氧化活性的蓝藻橙色类胡萝卜素蛋白和模式识别受体CRP。这些额外工作及其包含的研究思路和方法无疑会有助于本项目研究的完善和拓展。