小桐子液泡膜H+转运焦磷酸酶的定向进化及用于小桐子抗逆性遗传改良的研究

小桐子是目前最被看好的生物能源和生态造林首选树种，但它的生长和产量受非生物逆境（如干旱、低温、土壤贫瘠）的严重制约。液泡膜H+转运焦磷酸酶(H+-PPase)对植物诸多抗逆性都具有独特的作用，但仍存在大的提升空间，而蛋白质定向进化可能是对其特性进行分子改良从而充分发挥它功能潜力的最佳途径。本项目将以小桐子液泡膜H+-PPase(JVP1)为研究对象，拟采用三种定向进化技术（错误倾向PCR、DNA 改组和饱和突变）以及简单且适配JVP1的酵母耐盐性表型筛选系统，获得高H+转运活性和高耦联比的JVP1突变体。然后，利用这种改良突变体及野生型JVP1基因对小桐子进行遗传改良，通过对比研究最终得到高抗逆性转基因小桐子植株，从而大力推动我国小桐子产业快速稳定发展。另外，本项目还可以为提高其它植物的抗逆性提供关键基因来源和有助于研究质子泵能量转换的耦联机制，因而在应用和基础研究两方面都具有重大意义。

H+转运焦磷酸酶（H+-PPase）在植物诸多逆境适应中起着独特作用。对能源植物小桐子H+-PPase（JVP1）酶学特性进行分子改良并用于小桐子抗逆遗传工程应该会推动小桐子产业快速发展。本项目研究内容主要是JVP1定向进化及其相关转基因植物的抗逆分析，取得的结果包括：（1）JVP1全长cDNA得到克隆；其应答表达与小桐子对非生物胁迫（盐、旱、热、冷）的内在耐受性呈现较大一致性；异源表达JVP1能有效提高大肠杆菌和酵母的耐盐性，其介导的酵母耐盐性还能被N端融合克鲁斯锥虫H+-PPase的液泡定位信号肽极大增强。（2）利用错误倾向PCR结合DNA改组法以及酵母耐盐性筛选系统对JVP1进行了定向进化，获得了酵母耐盐性显著提高的JVP1突变体，但经生化鉴定不是预期的高耦联比（H+转运/PPi水解）突变体，其酵母抗盐效果也没有在其转基因烟草植株中重现。当中可能原因、项目实施中其它一些问题和原因以及下一步的工作设想已给予说明。不过，在项目期间基于多方面考虑还开展了其它一些与本项目或与植物抗逆总体相关的工作并取得一定进展，包括：（3）从人肠道宏基因组中扩增得到甲基戊糖梭菌膜结合焦磷酸酶（CmPP，推测为一个Na+,H+-PPase）基因。CmPP异源表达能显著提高大肠杆菌和酵母的耐盐性及其转基因烟草植株的抗盐和抗旱能力。（4）从酵母中新鉴定出一个液泡定位信号肽，通过N 端融合能有效增强膜PPase（JVP1、CmPP）介导的酵母耐盐性。（5）鉴定出一个派生于大亚型Rubisco活化酶羧基端延伸段、具热稳定作用的酸性化小肽。它用作C端融合接头能显著提高植物热不稳定蛋白（拟南芥和烟草Rubisco活化酶、小桐子抗坏血酸过氧化物酶1（JcAPX1）和TATA盒结合蛋白1（JcTBP1））的热稳定性，还能有效保护JcAPX1酶免受热失活以及增强JcTBP1介导的酵母耐热性。（6）研究发现几种超酸性融合接头均能增强小桐子和拟南芥APX1的热稳定性并显著提高其酶活耐热性（至少2℃）。（7）完成小桐子全转录组测序及低温关联的数字基因表达分析。这些额外工作及其包含的研究思路无疑会有助于植物抗逆性的遗传改良。