产碱假单胞菌中龙胆酸代谢直接水解途径的研究

Gentisate is an important intermediate for the biodegradation of many aromatic compounds. The first step of gentisate pathway is a ring-cleavage reaction catalyzed by gentisate 1,2-dioxygenase, transforming gentisate to maleylpyruvate (MP). There are two different pathways for the subsequent metabolism of MP: isomerization route and direct hydrolysis route. Most reports on gentisate pathway focused on the MP isomerization route, while complete direct hydrolysis route has never been reported at molecular level so far. It was reported that gentisate could be metabolized through direct hydrolysis route in Pseudomonas alcaligenes NCIMB 9867, and D-malate was detected as an intermediate during the process. This project is aiming to the exploration of the maleate hydratase encoding gene. Through the molecular-level study of this enzyme, the intact direct hydrolysis route in this strain will be elucidated. Meanwhile, as a product of maleate hydration, D-malate can be widely used in industrial manufacture. The obtained encoding genes of direct hydrolysis route provide basic component for the metabolism modification of Corynebacterium glutamicum. The switch of isomerization route to direct hydrolysis route will convert Corynebacterium glutamicum to an engineered strain producing D-malate from 3-hydroxybenzoate.

龙胆酸代谢是微生物分解代谢芳烃化合物的一条重要途径。龙胆酸经龙胆酸1，2-双加氧酶催化的开环反应形成顺丁烯二酸单酰丙酮酸（Maleylpyruvate, MP），MP的后续代谢有异构和直接水解两种途径。对龙胆酸代谢途径分子水平的报道几乎都是MP的异构途径，而MP直接水解途径到目前为止仍无完整的报道。产碱假单胞菌NCIMB 9867中龙胆酸能够通过直接水解途径进行代谢，且在该过程中能够检测到中间产物D-苹果酸。本项目将在NCIMB 9867菌株中克隆和鉴定MP直接水解产物顺丁烯二酸代谢的关键酶—顺丁烯二酸水合酶的功能基因，从分子水平阐明直接水解代谢途径完整的代谢通路。同时，顺丁烯二酸的水合产物D-苹果酸在工业生产中具有较高的应用价值，在对MP直接水解途径分子水平研究的基础上，本项目将通过代谢工程技术手段对谷氨酸棒状杆菌的龙胆酸代谢途径进行改造，使其能够利用3-羟基苯甲酸进行D-苹果酸的生产。

龙胆酸（2,5-二羟基苯甲酸）代谢途径是许多芳烃化合物代谢进入三羧酸循环的一条重要的途径。龙胆酸经龙胆酸1,2-双加氧酶催化的开环反应的产物顺丁烯二酸单酰丙酮酸（MP）的后续代谢有两种代谢方式：一种是异构后水解，一种是直接水解，前者已经在多株菌里有分子水平报道，而后者虽然已经在产碱假单胞菌中发现了MP水解酶（MPH）的编码基因hbzF，然而其水解产物顺丁烯二酸通过水合酶继续代谢以及完整的龙胆酸代谢直接水解途径目前在分子水平的研究依然是一个空白。.本项目在产碱假单胞菌NCIMB 9867的自然突变株SponMu中，对hbzIJ基因的克隆表达及酶学分析我们发现，HbzIJ可以作为龙胆酸代谢直接水解途径中的关键酶，催化MP的水解产物顺丁烯二酸发生水合反应，100%形成D-苹果酸。通过对hbzG基因的克隆表达及酶学鉴定我们发现其编码的是一个GSH依赖型MPI，随后我们通过基因敲除，分别获得了MPH和MPI缺陷株。通过对这两株缺陷株生长分析我们发现，在菌株SponMu中龙胆酸代谢并最终进入三羧酸循环依赖的依然是MP异构后水解途径，而MP直接水解途径在生成D-苹果酸后不能够继续代谢，可能是因为缺少与D-苹果酸代谢相关的酶。随后我们通过基因重组的方法在MPI基因缺失的菌株中导入了D-苹果酸脱氢酶基因（菌株SponMu-hbzG::dmlA），这一重新构建的工程菌株能够通过龙胆酸代谢直接水解途径以龙胆酸为唯一碳源生长，这是首次在分子水平证明了该条途径在微生物中存在的可能性。鉴于D-苹果酸在药物及新兴材料合成中的应用，我们尝试以龙胆酸代谢直接水解途径中的关键酶的编码基因对谷氨酸棒状杆菌中的龙胆酸代谢异构途径进行替换及改造，目前已获得能够利用3-羟基苯甲酸为底物生产D-苹果酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，这是利用可再生原料生产D-苹果酸的一个新的途径。.