草鱼Ⅰ型干扰素基因转录的分子机制

病毒病的频发已经成为制约草鱼养殖健康发展的一个突出因素。由于目前的防治方法都存在或多或少的不足，因此，对草鱼干扰素，特别是具有广谱抗病毒潜能的Ⅰ型干扰素的研究一直备受关注。为了解草鱼Ⅰ型干扰素基因转录的分子机制，本研究拟对其启动子、IRF-E和主要的干扰素调控因子IRF进行分析。首先克隆出7个启动子片断，每个片段包含1个或几个IRF-E，构建荧光素酶报告基因重组载体。同时，克隆多个草鱼干扰素调节因子(IRF)全长或功能域cDNA，并与pcDNA3.1连接。原核表达草鱼IRF的完整开放阅读框或相应的DNA结合域，凝胶阻滞分析草鱼IRF与Ⅰ型干扰素不同的启动子区域的结合。转染培养细胞以确定控制草鱼Ⅰ型干扰素基因转录的主要启动子区域和主要的草鱼IRF。该研究结果将为我们进一步了解草鱼Ⅰ型干扰素启动子不同区域、IRF-E和IRF与基因表达的关系，最终为草鱼病毒病的免疫防治提供理论依据。

在实验室已克隆1个草鱼Ⅰ型干扰素基因组及其启动子序列的基础上，我们对其序列特征进行了分析，发现草鱼Ⅰ型干扰素基因启动子包含启动子也包含一个典型的TATA box，4个IRF-E结合位点，两个NF-κB位点以及一个ATF-2/c-Jun结合位点。根据其启动子的结构特征，我们克隆了含有元件的CiIFN启动子片段(CiIFNP1-P9)。同时，在克隆草鱼IRF-7的基础上，通过原核表达系统获得草鱼IRF-7DBD结构域蛋白。凝胶阻滞分析得出草鱼IRF-7能够在体外与IFN各个启动子片段结合，为证明它们对IFN的调控作用提供了可靠的证据。我们还利用共转染实验技术，将CiIRF-7和IFN启动子片段分别转染至小鼠骨髓瘤细胞和草鱼肾细胞，结果表明草鱼IRF-7对Ⅰ型干扰素的正调控作用。.本研究克隆和鉴定了草鱼干扰素调节因子2(CiIRF-2)和调节因子3(CiIRF-3)，并着重对实验室先前克隆的IRF-1的功能进行了分析。CiIRF-2全长cDNA 为1809 bp，其中包括35 bp的5´非翻译区(5´-UTR)、834 bp的3´非翻译区(3´-UTR)和1个编码326个氨基酸的981 bp的最大开放阅读框(ORF)。这个推测编码的CiIRF-2包含1个含有6个保守色氨酸(W)残基的保守DNA结合结构域(DBD)。CiIRF-3的全长cDNA包含1831 bp，其中含1个269 bp的3´-UTR、1个195 bp的5´-UTR及1个1377 bp的最大ORF。这个ORF推测编码458的氨基酸的蛋白质，其N-端包含一个含有5个保守色氨酸的DBD结构域，而其C-端则包含1个较保守的IRF协助结构域(IAD)。.CiIRF-1均有较低的本底表达，但当有Poly I:C或重组草鱼干扰素(rCiIFN)刺激时，CiIRF-1的表达量将迅速上调。重组CiIRF1与草鱼IFN及IRF1的启动子片段均有不同程度的结合。重组质粒pcDNA3.1-CiIRF-1与pGL3-CiIFNPs/IRF1共转染草鱼肾脏细胞(CIK)或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，然后检测荧光信号。结果表明单独转染pGL3-CiIFNPs/IRF1的细胞荧光信号要比其与pcDNA3.1-CiIRF-1共转染的细胞荧光信号要弱挺多。CiIRF-1在草鱼IFN及IRF1的转录过程中均扮演着正调控因子的作用。