致羔羊脑炎粪肠球菌新毒力因子基因筛选、突变株构建及其生物学特性研究

肠球菌在医学临床中引起的感染已日益严重，其感染率仅次于葡萄球菌位于第二位,是所谓"超级细菌"重要成员。其中粪肠球菌的分离率最高。肠球菌感染成为临床治疗棘手问题原因之一是产生众多的毒力因子。目前已发现的毒力因子就有十余种，但肠球菌的致病机制仍不清晰。而动物肠球菌的研究还处于起步阶段。项目申请单位由发生脑炎羔羊体内分离到11株肠球菌，其中9株肠球菌携带多种毒力因子基因，2株不携带十余种毒力因子基因中的任何一种，但依然能引起感染的发生。据此推测该菌株可能存在其它未知毒力因子。本研究旨在利用抑制差减杂交技术（SSH）筛选出致羔羊脑炎粪肠球菌新的毒力因子基因，用同源重组的方法建立该菌毒力基因缺失平台，构建候选基因的突变株。通过研究突变株一系列的生物学特性确定新发现毒力因子的致病性、免疫原性等，为今后动物肠球菌致病机理的深入研究搭建良好技术平台和提供有用的线索。

肠球菌是人类和动物消化道正常菌群重要成员之一，一直作为有益微生物进行研究。但近年来在医学临床当中的感染已经越来越受到人类的的关注。兽医临床也有动物感染的报道。肠球菌引起感染究其原因除了其独特的耐药性以外还有众多的毒力因子的参与。目前发现的毒力因子有十余种，但肠球菌的致病机制还不清晰,是否还有其他毒力的参与还不得而知。因此本项目以导致羔羊脑炎粪肠球菌为研究对象，在全基因组测序基础上，应用软件分析和预测，筛选出了可能与细菌致病性有关的6个表面蛋白基因和4个与代谢有关的关键酶基因；11株致羔羊脑炎粪肠球菌分离株携带EF2224基因，10株拥有EF0591，EF2505，EF3183，EF1269基因，9株拥有EF1092基因，2株拥有EF2525基因，11株羔羊脑炎细菌都含有GlnA，LuxS，Pfs，SigA以及EF1553基因；不同粪肠球菌表面蛋白基因核苷酸同源性在95 %以上；GlnA，LuxS，Pfs，SigA四个酶基因与来自其它细菌（葡萄球菌、假单胞菌、猪链球菌、肺炎双球菌等）相应氨基酸同源性在66% 以上；信息学分析结果表明EF3183和EF0591基因序列包含有 1 个 1056 bp 和1435bp的完整开放阅读框，编码351 和478个氨基酸，有 2 个跨膜区，有 15 和13个抗原表位；采用同源重组方法分别构建了表面蛋白EF3183和EF0591两个基因的缺失株，发现缺失株对Hela细胞粘附性降低、对小鼠巨噬细胞RAW264.7侵染能力下降、感染小鼠脏器载菌量增加以及生物膜形成能力也明显下降；通过制备表面蛋白EF3183单克隆抗体表明突变株对细胞的粘附能力下降。研究结果表明筛选并证明新的表面蛋白EF3183和EF0591与粪肠球菌的致病力关系密切，该项目研究成果为阐明肠球菌致病机制提供了有用数据。