葡萄抗病相关磷脂酶D基因的分离和功能鉴定

磷脂酶D（PLD）是植物中一类主要的磷脂水解酶，在植物响应生物胁迫和非生物胁迫的过程中都具有重要作用。酿酒葡萄基因组序列框架图的完成为其功能基因的鉴定和分析提供了序列资源。本项目拟在前期研究的基础上，采用生物信息学和实验方法相结合的策略分离葡萄基因组中磷脂酶D家族基因，筛选与抗病相关的磷脂酶D基因，制备其多克隆抗体；通过对PLD活性和水杨酸（SA）生物合成的抑制处理，研究PLD、SA在葡萄果实抗病反应中的作用和其互作关系；构建转正、反义葡萄PLD基因的转基因植物，进一步分析验证PLD在抗病反应中的功能，阐明其作用的分子机理。本项目的研究结果能够进一步阐明PLD家族基因的生理功能和作用机理，从而为通过生物技术育种从根本上改善葡萄抗病性提供理论依据和技术支持。

磷脂酶D在植物体抵御生物及非生物侵害中发挥了重要作用。利用电子克隆和RT-PCR相结合技术，从葡萄果实（Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon）细胞中克隆得到12条磷脂酶D基因的CDS区，均含有HKD结构域。这12条VvPLD划分为6种亚型（2个VvPLDα, 2个VvPLDβ, 3个VvPLDδ, 1个VvPLDε, 1个VvPLDρ和1个VvPLDζ），3种结构型（C2-PLD, PXPH-PLD 及 SP-PLD）。当病原菌侵染葡萄细胞时，呈现出不同的表达模式，VvPLDα1、β1、β2、δ2、ε、ρ、ζ表现为上调表达，VvPLDα、 δ为下调表达，VvPLDδ1的表达变化依菌种而变化，其中以VvPLDα1的表达变化最为显著。PLDα的酶活性及蛋白表达量也明显升高，且水杨酸含量也升高。当外源施加0.8 mM水杨酸后，可延缓细胞受病原菌侵害，VvPLDα1的表达量酶活增加。外源施加水杨酸抑制剂多效唑之后测定PLDα的酶活一直下降，表明水杨酸的合成能够调控VvPLDα1。VvPLDα的启动子序列含有SA、JA、GA、MYB及与WRKY转录因子相结合的W-box等结合元件，说明VvPLDα1受多种因素调控。