版纳微型猪近交系生精障碍关键基因pSeptin12、14的功能与作用机制研究

Banna Mini-pig Inbred Line (BMI) is the first successfully cultivated large mammal inbred line in the world. The appearing of sterility in boar during the period of cultivation have caused several sublines to terminate and obstructed BMI population multiplication. The fact that the expression of Septin12 and Septin14 of Septin gene family member were testis-specific and age-dependent and high in the fertile boar while low in infertile boar founded by transcriptome sequencing and express analysis of infertility and fertility boar testicles suggested that Septin12 and Septin14 genes may play an important role in spermatogenesis. In this study, we intends to detect structural differences of Septin12 and 14 gene between the infertility and fertile boar on DNA level, look for the functional SNP loci and conduct functional verification via cell experiment. Further, we can speculate the molecular mechanisms for different expression between the infertility and fertile boar. We will study the expression pattern and identify interacting proteins of Septin12 and Septin 14 on protein level by western blot and yeast two-hybrid technology. We will interfer the expression of Septin12 and Septin 14 in Sertoli cells by RNAi technology and analyze the differentially expressed genes by RNA-seq in order to reveal their signaling pathways and possible regulatory mechanisms in spermatogenesis. These study will provide a theoretical basis for clarifying the spermatogenesis failure mechanism and propose a breeding guidance for BMI.

版纳微型猪近交系是世界上首个培育成功的大型哺乳动物近交系，培育期间出现的不育公猪致多个亚系断代，影响群体扩繁。前期我们对近交系不育和可育公猪睾丸的转录组测序及表达分析发现Septin基因家族的pSeptin12和pSeptin14在可育公猪睾丸中高表达在不育公猪中弱表达，且呈睾丸特异性和年龄依赖性，提示其可能在精子发生中发挥重要作用。本研究拟从DNA水平检测不育和可育公猪中pSeptin12、14基因的结构差异，寻找功能SNP位点并通过细胞功能实验进行验证，推测其在不育和可育公猪间差异表达的分子机制；利用免疫印迹、酵母双杂交等技术从蛋白水平研究其表达规律，鉴定与其互作的蛋白；运用RNAi技术干扰pSeptin12、14在睾丸支持细胞中的表达，然后通过RNA-seq分析差异表达基因，揭示其在精子发生中可能的信号通路及调控机制，为阐明版纳微型猪近交系生精障碍机理提供理论依据，并提出育种指导方案。

版纳微型猪近交系（BMI）是云南省宝贵的遗传资源，在生命科学领域具有重要研究应用价值。胞质分裂（Septin）基因家族属于GTP酶超家族，共有14个成员，其中Septin12、14在维持精子细胞的形态和分化方面具有重要作用。本项目克隆了BMI Septin12、14的完整CDS序列，GenBank登录号（KU358532和JX477173），对其编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。通过qPCR技术检测了Septin12、14 mRNA在34个组织的表达发现它们仅在睾丸和精囊腺表达；睾丸10个发育阶段的表达显示在初生公猪未见表达，2.5月龄表达极显著升高（p<0.01），5、7.5、8.5、11、13.5、15.5和18月龄间无显著差异，36月龄时有极显著下降；Wester Blot检测的蛋白质表达与mRNA水平表达结果一致。利用RACE技术扩增了Septin12、14的5’端序列，确定了这两个基因的转录起始位点分别为A和G，并利用DNA获得了Septin12、14的启动子序列，发现均不存在CpG岛，但存在多个CpG位点。构建的绿色荧光融合蛋白真核表达载体pEGFP-C1-Septin12、14亚细胞定位结果表明，Septin12、14蛋白呈点或斑状分布于核周围的线粒体上。酵母双杂交技术构建了pGBKT7-Septin12、14载体以及AD文库，筛选到与Septin12互作的基因有14个（MRPS9、ETFA、CENPL、GMCL1、WFS1、ATP1B3、Septin5、TOM1L1、LDHB、ENO1、E4F1、ATAD5、ZNF251、LOC），与Septin14互作的基因有1个（ZNF251）。以上结果表明Septin12和Septin14结构、功能较为相似，筛选到同一互作基因ZNF251，此外还发现Septin5与Septin12互作。因此，继续探究了Septin家族其他成员，克隆了Septin1-11的完整CDS序列，GenBank登录号（KU358533-KU358544），生物信息学分析发现，Septin家族均含Septin/CDC_Septin功能结构域。该家族可分为3组：（Septin6、8、10、11、14），（Septin1、2、4、5、7）和（Septin3、9、12）。以上结果为探索BMI公猪精子发生过程的分子机制奠定基础。