宿主xCT抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌MSH氧化的作用机制

Novel drugs are urgently needed to prevent the uncontrolled development of MDR-TB. Mycothiol (MSH) which is a major low molecular weight found in Mycobacterium tuberculosis (MTB) and acts as an antioxidant to maintain the highly reducing environment within the cell, is associated with virulence and drug resistant in MTB. MTB with oxidized MSH is more sensitive to antibiotic and early to killing by macrophages. We found that disrupt of xCT by SASP enhanced the mycobateriacidal activity of macrophage through decreasing the intracellular GSH production. However, the mechanism remains unknown. we further found that disruption of xCT affected the CydD and SseA mutants’ fitness which are associated with MSH oxidation in macrophage. Based on our results, we hypotheses that xCT inhibits MSH oxidation through increasing GSH production in macrophage and affects SseA/CydD regulation network. This project will further study the mechanism of xCT inhibit MTB MSH oxidation in macrophage using Crispr-Cas9, Tn-seq and RNA-seq. The accomplishment of this study will provide novel targets and strategies to cure tuberculosis.

研发新型抗结核新药是当前克服耐多药结核的重要课题。分枝硫醇(MSH)是结核分枝杆菌（结核菌）最主要的小分子量硫醇及氧化还原缓冲剂，直接影响结核菌的毒力和抗药性。氧化型MSH结核菌更容易被细胞杀死以及对药物更加敏感。我们前期发现，采用柳氮磺胺吡啶抑制宿主细胞xCT基因功能，通过降低巨噬细胞中GSH的水平显著提高氧化型MSH结核菌的数量，从而增强巨噬细胞对感染的结核菌杀灭作用，但其具体机制尚不清楚。进一步研究发现抑制xCT影响结核菌MSH氧化调控相关基因CydD/SseA等突变株的存活。基于此，我们提出假设：宿主基因xCT通过增加巨噬细胞中GSH水平、影响结核菌调控氧化相关SSeA/CydD基因的表达网络，进而抑制结核菌MSH氧化。本项目将进一步利用Crispr-Cas9、转座子测序、RNA-seq等技术，阐明宿主xCT抑制结核菌MSH氧化作用机制，为靶向xCT定向治疗结核病策略提供科学依据。

结核病由结核分枝杆菌感染引起的一种复杂的传染性疾病。由于缺乏有效的结核病疫苗、理想的实验室诊断技术和耐多药结核发生，使得结核病在全球的防控形势非常严峻。研发新型抗结核新药是当前克服耐多药结核的重要课题。分枝硫醇(MSH)是结核分枝杆菌（结核菌）最主要的小分子量硫醇及氧化还原缓冲剂，直接影响结核菌的毒力和抗药性。氧化型MSH结核菌更容易被细胞杀死以及对药物更加敏感。我们前期发现，采用柳氮磺胺吡啶抑制宿主细胞xCT基因功能，通过降低巨噬细胞中GSH的水平显著提高氧化型MSH结核菌的数量，从而增强巨噬细胞对感染的结核菌杀灭作用，但其具体机制尚不清楚。本本项目中，我们发现xCT主要通过NADPH氧化酶通路调控MSH的氧化，同时也确定了xCT特异抑制剂柳氮磺胺吡啶（Sulfasalazine，SASP）其本身直接影响结核菌分枝硫醇（MSH）的氧化及增强巨噬细胞的杀菌功能，而不是通过其代谢产物5-氨基水杨酸（5-amino salicylic acid，5ASA）和磺胺吡啶（sulfasyridine，SP）起作用。通过转座子插入突变测序技术，研究在不同处理巨噬细胞中结核菌突变文库的丰度，我们获得了SASP处理组巨噬细胞中基因插入突变结核菌株的丰度的变化水平，并分析了差异显著插住突变株所富集的通路，发现了一些列与结核菌氧化水平变化相关的基因，明确了SASP影响巨噬细胞中结核菌氧化相关基因调控网络，并确定了SseA基因的敲除显著影响了结核菌分枝硫醇MSH的氧化，明确了巨噬细胞调控胞内结核菌基因表达进而影响MSH氧化的机制。同时发现了发现了xCT功能性SNP（rs13120371）与xCT表达水平密切相关，高表达xCT的结核病人其病情更加严重，以及其巨噬细胞抗结核菌的能力显著低于低表达xCT的结核病患者，并进一步明确调控xCT表达的miRNA，这些结果为我们下一步进行靶向xCT精准治疗结核病具有重要的意义。