牛源非结核分枝杆菌（Nontuberculous Mycobacteria，NTMs）与宿主巨噬细胞（Mφ）相互作用的分子机制研究

The rate of infection and the detection of Non Tuberculous Mycobacteria in clinically and production are special high,which bring huge barriers to diagnose and treat the human tuberculosis and clearance cattle TB positive cow.NTMs and Tuberculous Mycobacteria belong to mycobacteria and the genomes have higher homology.This research focuses on the basis of separating and identifying more than 300 strains of mycobacterium tuberculosis from animal body.The NTMs with fruit flies S2 and mammals Macrophages are co-culture, detecting the MHCII expression regulation through the M φ mannose receptor molecules MR;We detect the secretion of IL-10 how to effect of sTNFR2 and Fas expression that inhibits the apoptosis of M φ phagosome itself.NTM changes the structure of IFN-rR reducing the antigen presentation function of CD4 to macrophages and inhibit M φ gobbling up of NTMs through TLR2 pathway.These results will initially revealed the immune clearance molecular mechanism of the mycobacterium tuberculosis eludeing the body M φ, providing a theoretical basis for further research.

非结核分支杆菌（Non Tuberculous Mycobacteria,NTM）在临床上的和生产上的感染率和检出率特别高，给人结核病的准确诊断和治疗、牛结核病阳性牛的淘汰工作都带来了巨大的障碍。NTMs与结核分枝杆菌（Tuberculous Mycobacteria, TM）同属分支杆菌属基因组之间有较高的同源性。本研究拟在前期从动物体内分离鉴定300余株非结核分支杆菌的基础上，通过NTMs与果蝇S2和哺乳动物巨噬细胞(Macrophages,Mφ)共培养，检测NTMs通过Mφ甘露糖受体MR对MHCII分子表达调节；检测分泌IL-10对sTNFR2的作用影响Fas表达而抑制Mφ吞噬体的自身凋亡；NTM改变 IFN-rR的结构降低CD4对巨噬细胞抗原递呈功能及通过TLR2等途径抑制Mφ对NTMs的吞噬。这些结果将初步揭示非结核分枝杆菌逃避机体Mφ免疫清除分子机制，为下一步研究提供理论依据。

非结核分枝杆菌是一种人兽共患病原菌，在临床上和生产上的感染率和检出率呈上升状态，国内有关非结核分枝杆菌的研究相对较少，尤其是在NTM感染巨噬细胞逃避免疫清除的分子机制方面。课题组首先制备了NTM感染C57BL/6小鼠及RAW264.7小鼠巨噬细胞和人THP-1细胞模型。通过观察非结核分枝杆菌被巨噬细胞的吞噬、增殖情况，筛选出在巨噬细胞内增殖能力较强的母牛分枝杆菌和新金分枝杆菌，与M. bovis BCG相比较，研究它们的感染特性及宿主免疫机制，特别是与巨噬细胞凋亡、抗原递呈及CD4+T淋巴细胞极化相关的免疫机制，进而探讨非结核分枝杆菌感染过程中巨噬细胞及T淋巴细胞的免疫调节作用。体外试验结果表明M.vaccae及M.neoaurum感染RAW264.7细胞后，均可促进细胞凋亡，并在感染后4h开始上调TLR2、TLR4、MHCⅠ、MHCⅡ及CD80、CD86，并且也上调了TNF-α、IL-12p40、IL-10的表达（P<0.05）。但在感染24h以后，TLR2、TLR4、MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86、TNF-α、IL-12p40的表达下降，而抑制性细胞因子IL-10的表达量并没有降低。小鼠体内的这些反应与体外M.vaccae及M.neoaurum感染RAW264.7细胞的结果一致。另外，研究发现M.vaccae和M.neoaurum感染后对小鼠机体形成了严重的伤害，但伤害程度不同。研究NTM感染对小鼠肺T淋巴细胞亚群的影响，发现M.vaccae及M.neoaurum感染前期以CD4+T细胞免疫为主，感染后期以CD8+T细胞免疫为主，而作为对照的BCG组整个感染过程中均升高CD4+T细胞免疫。课题组还深入研究了巨噬细胞中TLR2、TLR4以及一些细胞因子对NTM的免疫调节作用，结果显示，浅黄和新金分枝杆菌感染均可上调TLR2，TLR4和TNF-α的表达水平，并且TLR2及TLR4基因上调水平与TNF-α的上调水平呈现出正相关性变化，初步推测新金分枝杆菌的毒力要强于浅黄分枝杆菌。此外，还探讨了NTM是否通过TLR调控炎症反应和介导相关信号通路的转导，结果显示M.vaccae可通过TLR4介导小鼠巨噬细胞RAW264.7激活MAPKs信号通路；TLR4激活可能抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7 NF-κB信号通路的传导。