葡萄果实中无色花色素还原酶与小分子量热激蛋白互作的生物学功能研究

基于原花色素的保健功效及其对葡萄酒感官品质的重要贡献，有关其合成与调控的研究受到极大关注，但迄今为止，该领域的研究主要集中在关键酶基因的表达调控上，这些酶是否在蛋白水平上受到调节仍然未知。无色花色素还原酶（VvLAR）是葡萄原花色素生物合成的关键酶之一，本课题组前期研究证实了在酵母体系中VvLAR1与小分子热激蛋白（VvsHSP1）有互作关系。本项目拟在此基础上，研究VvLAR1与VvsHSP1发生互作的关键区段；分析葡萄果实中VvsHSP1基因在特定条件下的表达及其亚细胞定位，探明果实细胞中两种蛋白发生互作的条件、发育时期及胞内区域；进而研究果实中VvLAR1和VvsHSP1的互作对VvLAR1活性和产物积累的影响，以阐明其互作的生物学意义；结果不仅可以拓展葡萄果实原花色素生物合成的调控理论，而且还能够揭示逆境下葡萄重要风味代谢的稳态机制，为运用栽培技术提高酿酒葡萄风味品质提供理论依据。

无色花色素还原酶(Leucoanthocyanidin reductase, LAR) 催化2R,3R-黄烷-3R,4S-二醇生成2R,3S-(+)-黄烷-3-醇类物质(+)-儿茶素，后者是原花色素的组成单元之一。葡萄果实中原花色素不仅决定着葡萄酒产品涩、苦味的优劣和强弱，而且影响着葡萄酒的色泽和贮藏寿命，但迄今关于葡萄原花色素生物合成调控的研究仅停留在转录水平上，它们是否在蛋白水平上受到调控仍然未知。本课题组发现在酵母体系中VvLAR1与小分子热激蛋白(VvsHSP1)存在互作关系，本项目在此基础上，分别构建不同VvLAR1和VvsHSP1蛋白片段载体，采用酵母双杂交技术确定了其互作区域在VvLAR1182-346与VvsHSP1251-367；拟南芥原生质体亚细胞定位表明， VvLAR1与VvsHSP1均定位于细胞质，存在共定位现象；通过酵母总蛋白免疫共沉淀实验、烟草叶片瞬时表达系统的荧光素酶互补实验、重组蛋白的体外免疫共沉淀实验以及两基因纯合体单转植株杂交F1代体内免疫共沉淀实验四个证据充分证实了这两个蛋白互作关系的存在；为探明VvsHSP1与VvLAR1蛋白互作在葡萄果实发育过程中的生物学功能，我们建立了HPLC-MS检测VvLAR1酶活性的方法，研究添加VvsHSP1重组蛋白对VvLAR1酶活性影响，结果显示，与添加BSA(牛血清白蛋白)或灭活的HSP1的对照相比， 添加VvsHSP1可提高VvLAR1酶活性，且在高温(50°C和40°C)和低温(10°C)下促进作用更为显著；对纯合体单转植株杂交F1代进行高温(40°C)和低温(10°C)处理后，两基因在转录、翻译水平上表达及儿茶素含量分析，进一步证明了VvsHSP1可在植物遭受温度胁迫情况下有效保护VvLAR1活性，保证其功能的发挥。此外，我们分析不同温度和紫外光处理对葡萄果实VvLAR1与VvsHSP1表达的影响，结果表明，转色前果实的VvsHSP1对10°C诱导的响应最为强烈，40°C处理对VvLAR1表达的影响要远远大于10°C处理组；紫外滤减可显著提高葡萄幼果中的VvsHSP1及成熟果实中的VvLAR1的表达量；此外，UV-C照射可以显著上调转色前及转色期果实中的VvsHSP1与VvLAR1的表达。此研究结果首次在蛋白水平上阐明了葡萄原花色素合成调控机制，对优质酿酒葡萄的生产有一定的指导意义。