透过血-关节囊液屏障的牛膝下行作用及对栀子苷在实验性关节炎micro RNA-146a/124a—F-actin信号调节的影响

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, inflammatory and systemic autoimmune disease. RA may change the structure and state of blood-joint barrier (BJB) regulated by filamentous actin (F-actin) in fibroblast-like cells synoviocytes (FLS), so as to change its permeability. MicroRNA (miRs) is expected to become the new diagnostic markers and therapeutic targets for RA. Adjuvant arthritis (AA) model of rat is established in the research. Using the treatment of Geniposide (GE) and cells culture in vitro experiments, sites-microdialysis (sites-MD) technique; studying the interaction of pharmacokinetic and pharmacodynamic (PK-PD) online synchronization; applying pathomorphology, flow cytometry, immunofluorescence staining, real-time PCR and Western blot, we investigate the "drug-guide" effect of achyranthes bidentata, the level of F-actin in FLS, the effect of BJB on the permeability of GE, and the role of GE in G-protein coupled receptors and integrin receptors-MAPKs-miRs-F-actin signalling pathway, thereby further revealing the pathological mechanism of RA, exploring the scientific connotation of traditional Chinese medicinal guide, studying in-depth the effect of GE on therapeutic mechanism of RA, and providing a technical platform for screening new drug targets for the treatment of RA.

类风湿关节炎（RA）是一种慢性、炎症性、系统免疫疾病。RA可能通过改变受成纤维滑膜细胞(FLS)表达的肌动蛋白（F-actin）调控的血-关节囊液屏障（BJB）的结构和状态，改变通透性、清除率和代谢之间的平衡，大量有害物质在关节腔中聚集，加重病情。RA患者的滑膜液和外周血的多种细胞中，存在MicroRNA (miRs)的异常调节。miRs有望成为 RA 新的诊断标志物和治疗靶点。建立大鼠佐剂性关节炎(AA)和胶原性关节炎(CIA)模型，采用整体给药和体外细胞培养实验手段，多位点微透析技术在线同步研究药动-药效结合作用；应用病理形态学、流式细胞术、免疫荧光染色、实时PCR和蛋白免疫印迹技术，以AA和CIA大鼠FLS中miR146a和miR124a这一对相反变化趋势的miRs为突破口，探讨牛膝引药下行，FLS表达F-actin水平的改变、BJB对栀子苷（GE）通透性的影响，揭示中药引经理论的科学内涵，探究GE对G蛋白偶联受体和整合素受体-MAPKs-miR146a/124a-F-actin调号调节的影响，为构建筛选治疗RA新的药物作用靶点提供技术平台，为中药有效成分研究与应用提供实验依据。

类风湿关节炎(RA)是一种由多种炎症细胞介导的异常细胞免疫和体液免疫为发病机制的慢性、系统性免疫疾病。前期研究发现栀子苷(GE)恢复炎性/抗炎细胞因子的动态平衡，促进β2肾上腺素受体脱敏，抑制MAPKS信号通路中JNK、ERK和p38的过度磷酸化。还发现牛膝总皂苷(ABS)增加GE向关节滑膜组织转运的速度和程度。药物在关节处靶向聚集，与受成纤维滑膜细胞(FLS)表达的丝状肌动蛋白(F-actin)调控的血-关节囊液屏障(BJB)功能密切相关。应用多位点微透析技术在线同步研究整体和局部的PK-PD结合作用和药物在靶组织(关节腔)中的分布。建立佐机性关节炎(AA)大鼠血液和关节腔微透析取样方法、UHPLC-MS/MS检测炎性因子PGE2和1-磷酸鞘氨醇(S1P)方法，发现 GE组与合用组能降低关节腔与血液中PGE2和S1P的水平，PK-PD结合为滞后的间接模型；合用组在组织中的抗炎作用强于GE组，而血液中两者无显著差异。ABS通过增强GE由血液向关节组织的分布，发挥关节靶向引导作用。MicroRNAs(miR) 在 RA 发病中的作用渐成为研究热点，有望成为 RA 新的诊断标志物和治疗靶点，以其为切入点，从基因水平探讨BJB和ABS对GE引药作用机制。建立佐剂性关节炎大鼠FLS和RASFs炎症细胞损伤模型，应用病理形态学、流式细胞术、免疫荧光、RT-qPCR法和蛋白免疫印迹等技术，发现GE通过间接作用上调miR-124a的表达，抑制靶基因 整合素β1(Itgβ1)和RhoA表达增加，下调F-actin表达水平，抑制Itgβ1-Ras-Erk1/2-F-actin和RhoA-p38-NF-κB-F-actin信号转导的激活，使BJB对GE的通透性加大，促进GE在RA病变关节腔内靶向分布，发挥更强的抗炎免疫调节作用。采用UPLC-Q-TOF/MS法联合UNIFI平台对牛膝三萜皂苷分析鉴定及其在大鼠肠道菌群中代谢研究。鉴定40种三萜皂苷类成分，包括38个齐墩果烷型三萜皂苷、1个常春藤型三萜皂苷、1个machaerinate型三萜皂苷及39个代谢产物。拓展研究发现GE双靶调控SphK1和Erk1/2的过度磷酸化，抑制FLS的异常炎性增殖和血管新生，干预血管内皮细胞生物学功能的改变。成功申报国自然面上项目，更深层次揭示RA病理机制，为构建筛选治疗RA新的药物作用靶点提供技术平台。