融合蛋白质转导域的抗HBV核心蛋白穿膜抗体细胞内靶向抗病毒作用研究

通过增强病毒外膜抗原的免疫原性和突破宿主的免疫耐受，治疗和预防慢性病毒感染的效果非常有限。本课题以病毒高保守、强免疫原性的核衣壳蛋白为靶点，前期采用EDC化学偶联TAT和抗HBc 单克隆抗体，证实其体外抗原识别能力、穿膜效应和清除病毒的作用。在此基础上，拟进一步采用蛋白质转导技术、单链抗体表达技术和融合基因表达技术，构建和制备与TAT cDNA融合的抗HBc scFv cDNA的重组体，表达该人源化穿膜抗体。在HepG2.2.15细胞和HBV转基因小鼠模型中，证实抗HBc scFv-TAT融合抗体细胞膜穿透能力和细胞内靶向中和病毒核心蛋白，阻断病毒包装、复制的作用。旨在探讨使用原核表达技术制备的抗HBc scFv-TAT融合抗体治疗病毒感染的可行性。课题通过蛋白质转导技术建立细胞内阻断病毒复制和增殖的新的免疫学方法，是感染免疫学理论和系统抗感染免疫机制的补充和创新性探索。

HBV感染严重危害人类健康。无论是体液免疫还是细胞免疫，免疫作用机制是在细胞外液和细胞膜表面完成的。本研究依据HBV核心蛋白高保守性、强免疫原性和在HBV复制周期中的重要作用，提出打靶细胞内HBV核心蛋白，在细胞内发挥体液免疫功能，抑制HBV复制的新思路。本课题采用蛋白质转导机制改造目前仅作为感染指标的病毒核心抗体，制备HBcMAb-TAT PTD偶联抗体，证实偶联抗体的生物学功能，并通过HepG2.2.15细胞体外实验考察穿膜抗体在细胞水平的抗病毒作用；以感染鸭乙肝病毒（DHBV）的北京麻鸭为研究对象，原核表达DHBV core蛋白，采用杂交瘤技术制备DHBcMAb，并制备DHBcMAb-TAT PTD穿膜抗体，通过的北京麻鸭体内抗病毒实验考察穿膜抗体在整体动物水平的抗病毒效应。. 建立通用性强、灵敏度高、特异性强、重复性好，适于不同地区、不同鸭种、不同基因型的DHBV DNA定量检测的Taqman实时荧光定量PCR方法。建立鸭外周血DHBcAb IgY抗体的竞争ELISA检测方法。选择抗原不修复的SABC法，建立鸭肝组织DHBcAg免疫组化定量检测方法。客观评价整体动物实验的抗病毒效应。.研究结果证实，HBcMAb与TAT PTD成功偶联，HBcMAb-TAT PTD偶联抗体在体外仍然可以很好地识别HBcAg，并且可以跨膜进入HepG2.2.15细胞，分布于细胞质与细胞核，成为具有良好膜渗透能力的穿膜抗体。HBcMAb-TAT PTD穿膜抗体抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA复制和HBsAg、HBeAg分泌，以及细胞内HBcAg的水平，在体外具有抗病毒作用。DHBcMAb-TAT PTD穿膜抗体可以保持较好的抗原结合力，具有较持久的体内抗病毒作用。. 本课题设计了针对HBV核心蛋白的免疫清除原理来治疗HBV病毒感染。从针对病毒表面蛋白抗原表位转到针对病毒核心蛋白抗原表位的免疫清除设计是本课题的创新之一。使用蛋白质转导技术，修饰和制备穿膜抗体，通过PTD将天然抗体分子转导进入细胞内靶向病毒核心蛋白，抑制病毒组装和复制是在理论上使用了细胞内免疫机理，是系统抗感染免疫的创新探索。. 通过蛋白质转导技术建立抗HBV感染的细胞内免疫学治疗新方法，为HCV、HIV等疾病的治疗研究提供新的思路，为靶向核心抗原的穿膜抗体的开发奠定基础。