TnIc和HRE调控HGF在缺血心肌特异表达对猪心肌灌注与心功能的影响

治疗性血管新生为缺血性心脏病病人提供了全新的治疗策略，目前治疗性血管新生的方法主要包括蛋白、细胞和基因治疗等。其中生血管因子基因治疗缺血性心脏病的研究成果令人鼓舞，中国人民解放军军事医学科学院构建了Ad-HGF注射液，与本课题组多年合作研究，经临床前期和I期临床试验取得了较好的研究结果，鉴于基因转导和表达的低效率、载体引起的免疫反应等问题，尤其是未调控生血管因子过度表达以及心脏外脏器血管的新生大大降低了生血管因子基因治疗缺血性心脏病的安全性。因此本课题组构建了Ad-TnIc-HRE-HGF，发现该系统能够调控HGF特异表达在低氧和缺氧离体心肌细胞内。为了进一步验证该载体系统在动物体内缺血心肌的特异表达和治疗效果，拟构建猪心肌缺血模型，探讨TnIc启动子和HRE核心序列在动物体内对生血管因子表达调控作用，可望获得缺血心肌基因特异表达载体系统，为生血管因子临床应用提供新的思路和实验依据。

背景：未调控生血管因子的过度表达以及心脏外脏器血管的新生大大降低了基因治疗缺血性心脏病的安全性，本课题组通过筛选出的301bp心肌特异表达troponin I(TnIc)启动子序列调控目的基因在心肌特异表达，为心血管疾病的靶向基因治疗提供一种新的策略。.方法：通过PCR法扩增五个分子量大小为858bp 、491bp 、301bp 、165bp 、126bp的TnIc启动子序列，并通过电泳验证PCR扩增后序列的正确性。将五个TnIc启动子序列在骨骼肌细胞(L6)、成纤维细胞(3T3)、心肌细胞(H9C2)上进行表达特异性比较，筛选出在心肌细胞特异高表达的TnIc序列。将TnIc或巨细胞病毒（CMV）启动子调控的荧光素酶报告基因（Luc）或肝细胞生长因子（HGF）连接至腺病毒载体，利用荧光素酶检测体系检测转染后心肌（H9C2）、骨骼肌（L6）、成纤维（3T3）、肾（NRK）、仓鼠肺（CHL）和肝脏（BRL）细胞系后Luc的表达；并通过心肌局部注射至大鼠心脏，观察Luc或HGF在各脏器表达，以及转染后8周改善梗死模型心功能情况。.结果：离体实验转染Ad-TnIc-Luc后心肌细胞表达最高，与其他细胞系相比，连续五天均具有显著性差异(P<0.01)；在体实验与Ad-CMV-Luc组比较，TnIc组Luc在心脏表达特异性最强，体外荧光素酶检测示在体转染CMV组各脏器比TnIc组均高出100-1000倍（p<0.01）。心外膜注射Ad-TnIc-HGF、Ad-CMV-HGF、Ad-null或生理盐水至梗死大鼠心肌梗死周围，Western blot法检测结果显示TnIc组能特异调控HGF在心脏表达。心梗+生理盐水或空载体组在注射后第4周射血分数下降明显而心梗+Ad-CMV-HGF组射血分数上升了17%，并能持续到第8周，心梗+Ad-TnIc-HGF则未见到射血分数的明显提高。.结论：筛选出的301bp的TnIc能够特异性调控目的基因HGF在心脏的表达，并能够防止急性心肌梗死后心脏功能的恶化。但如何提高301bpTnIc启动子序列调控下的目的基因表达效率将是下一步研究重点。