牛膝活性肽的促神经生长和损伤修复作用及机制研究

Achyranthes bidentata Bl., a famous Traditional Chinese Medicine, has effects on strengthening tendons and bones and benefiting liver and kidney. Our previous studies have shown that Achyranthes bidentata polypeptides (ABPP) could exert neurotrophic and neuroprotective effects. To further illuminate the underlying mechanisms of ABPP, the effective extracts have been isolated from ABPP by using reverse-phase high performance liquid chromatography. Recently, an active peptide monomer has been further isolated from the effective extracts, robustly promoting neurite outgrowth and inhibiting apoptosis in neuronal culture. This project aims to systematically investigate the promoting effects of the active peptide on nerve growth and injured nerve repair by using neuronal growth model together with oxygen-glucose deprivation induced-neuron apoptosis model in vitro and rat sciatic nerve transection together with middle cerebral artery occlusion model in vivo. Transcriptome sequencing and bioinformatics analysis in combination with signal-flow construction will be used to identify the involved molecular signaling pathways of the active peptide on neuronal growth. Also, by using Q-TOF mass spectrometry together with Edman degradation, we are going to determine the primary structure of the active peptide. Taken together, our study will provide experimental data and contribute to developing clinical drugs/agents for promoting nerve repair of natural original Achyranthes bidentata active peptide.

中药牛膝具有强筋健骨、补肝益肾的功效。本课题组多年研究显示，牛膝中的多肽成分具有神经营养和神经保护活性，为深入阐明其作用机制，课题组采用反相液相色谱法从牛膝多肽中分离出活性组分，进一步对该活性组分进行分离纯化，得到一个活性肽单体。体外初步实验结果显示，该活性肽具有显著促神经元生长、抗神经元凋亡的作用。本课题拟分别采用体外神经元生长和氧糖剥夺诱导的神经元凋亡模型、体内大鼠坐骨神经横断和大脑中动脉栓塞模型，系统研究该活性肽的促神经生长和损伤神经修复作用；通过转录组测序和生物信息学分析，构建核心信号流，探寻该活性肽调控神经元生长的相关分子信号通路；采用Q-TOF质谱结合Edman降解法对肽的氨基酸序列结构进行表征。通过本研究为将牛膝活性肽开发为临床需要的促神经损伤修复新药提供实验依据。

中药牛膝具有强筋健骨、补肝益肾的功效。本课题组多年研究显示，牛膝中的多肽成分ABPP具有神经营养和神经保护活性，为深入阐明其作用机制，课题组采用采用反相高效液相色谱和质谱联用技术，在活性指导下对ABPP逐级分离得到牛膝活性肽单体ABPPk2并进行氨基酸序列和二级结构表征，并从转录组、分子、细胞、及整体动物水平探讨ABPPk2促神经生长和抗脑缺血损伤的生物学作用。结果显示，ABPPk2为含有33个氨基酸的序列长链肽，其二级结构为3对二硫键形成的反向平行折叠结构。ABPPk2能显著促进海马神经元的生长，并可显著增加海马神经元突起生长锥面积和丝状伪足长度、突起长度和突起数目、突起分支数目、突触密度，并上调突触后致密蛋白的表达；明显加快海马神经元突起生长速度。转录组测序及生物信息学分析结果显示，ABPPk2可显著上调转录因子Lhx8等以及神经发生和神经元分化相关基因；通过WGCNA-GO分析得到13个核心基因Satb2、Tmem2、Dlx1、Trim66、RGD1563615、Ctse、Rpap1、Ano1、Lhx8、Lgi1、Lrfn5、Ppp1r1b及Vax1；对其中一个核心基因Lhx8的表达进行验证，结果与芯片结果一致。体外氧糖剥夺损伤实验结果显示，ABPPk2能显著减轻氧糖剥夺诱导的神经元活力的下降，减少氧糖剥夺诱导的神经元活性氧产生，减轻氧糖剥夺诱导的神经元线粒体膜电位下降，有效抑制氧糖剥夺损伤诱导的神经元凋亡，明显抑制促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase 3的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并减少线粒体Cytochrome C和AIF的释放。体内大脑中动脉栓塞实验结果显示，ABPPk2能明显缩小脑梗死体积，降低脑组织中MDA含量，维持SOD的活力，有效维持缺血半影区神经元的完整性，明显改善缺血半影区的血管通畅率，显著减少血管内皮纤维蛋白和血小板沉积，减轻脑实质多形核白细胞浸润，显著抑制缺血半影区基质金属蛋白酶的活化，有效抑制细胞凋亡，抑制促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase 3的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达，能明显改善MCAO大鼠长期神经功能缺陷和学习记忆能力。相关成果发表SCI论文3篇，获中国发明专利1项，申请中国发明专利1项，培养硕士研究生2名、博士生1名。