Crif1竞争抑制PKI结合PKAαcat促进BM-MSCs放射后成脂分化的作用机制研究

The damaged structure and dysfunction of hematopoietic microenvironment causing myelosuppression is the main pathological mechanism of radiation bone marrow syndrome. However, the imbalance between osteogenic and adipogenic differentiation of BM-MSCs is the key event of the loss of hematopoietic support function. Researches have shown that irradiation caused the imbalance between osteogenic (weakened) and adipogenic (enhanced) differentiation of BM-MSCs. Our previous research showed that irradiation induced the high expression of Crif1 and the activation of PKAα cat promoting the adipogenic differentiation, but the molecular mechanism is unknown. Bioinformatic analysis reveal that Crif1 and PKI have key binding sites overlap on PKAα cat. Hence, we infer that Crif1 competitively inhibits the combination between PKI and PKAα cat promoting the adipogenic differentiation of BM-MSCs. To uncover the mechanism that how Crif1 regulates PKAα cat, we propose to construct the truncated mutants of Crif1 and PKAα cat to identify the key binding sites; on this basis, induce the mutations of core sequences to research the mutual relations of Crif1/PKI- PKAα cat in regulating the adipogenic differentiation of BM-MSCs after irradiation. We hope to clarify the mechanism of the imbalanced differentiation of BM-MSCs caused by Crif1 after irradiation and to provide a new way of thinking to hematopoietic reconstruction in the treatment of radiation bone marrow syndrome.

造血微环境结构和功能异常致造血抑制是骨髓型急性放射病的主要病理机制。而BM-MSCs成骨、成脂定向分化失衡是其造血支持功能缺失的关键环节。研究表明放射可致其成骨（减弱）、成脂（增强）定向分化失衡。前期研究发现，放射诱导BM-MSCs高表达Crif1并激活PKAα cat促进其成脂分化，其分子机制未明。生物信息学分析发现，Crif1、PKI与PKAα cat存在关键结合位点重叠。由此推测Crif1竞争抑制PKI结合PKAα cat促进BM-MSCs成脂分化。本项目拟构建Crif1及PKAα cat截短体确定二者相互作用关键位点，研究Crif1调控PKAα cat的机制；在此基础上，诱导核心结合序列突变，研究Crif1/PKI-PKAα cat调控BM-MSCs放射后成脂分化的相互作用关系，阐明Crif1致放射后BM-MSCs定向分化失衡的分子机制，为骨髓型急性放射病造血重建救治提供新思路。

造血微环境结构和功能异常致造血抑制是骨髓型急性放射病的主要病理机制。而BM-MSCs成骨、成脂定向分化失衡是其造血支持功能缺失的关键环节。研究表明放射可致其成骨（减弱）、成脂（增强）定向分化失衡，脂肪细胞对造血具有抑制作用。此外，脂肪细胞也是骨髓腔内破骨细胞分化关键因子RANKL的主要来源。成骨分化减少而破骨分化增强是放射致骨质疏松的主要病理机制。本项目从两方面进行研究：（一）Crif1促进放射损伤后BM-MSCs成脂定向分化的作用机制：通过对PKA激酶活性检测发现，在Crif1与PKA共同存在的体系下，Crif1可显著增强PKA的激酶活性； PKI与PKA共同存在的体系下，PKI会显著抑制PKA的激酶活性，而当Crif1 、PKI与PKA三者共同存在的体系下，Crif1可显著抑制PKI的作用；在体外敲除小鼠骨髓间充质干细胞（M-BMSCs）中的Crif1后，细胞成脂分化能力显著减低；通过构建Crif1骨髓特异性敲除小鼠模型，在体内研究证实敲除Crif1后，可显著减低辐射诱导的骨髓脂肪化。以上结果表明，Crif1同PKI竞争性的结合 PKA，并促进PKA激酶活性，进而促进CREB的磷酸化，从而启动成脂分化关键基因的转录表达，阐明了辐射致骨髓脂肪化和造血能力下降的分子机制；（二）Crif1促进放射损伤后骨质疏松的作用机制：辐射后Crif1表达升高并通过PKA-CREB信号通路促进RANKL的表达，进而促进破骨细胞的分化，而辐射后成骨分化是减少的，最终导致成骨/破骨失衡。课题组从PKA-α及Crif1的抑制剂筛选出发，通过生物信息学分析筛选出5个可以显著抑制Crif1-PKA相互作用的小分子化合物，为寻找促进造血恢复的抗辐射药物及抗骨质疏松药物筛选提供新的方向。