Crif1调控Nrf2核内稳定性抑制BMMSCs辐照后成骨分化的作用机制研究

The diminution of hematopoietic support functions of BMMSCs caused by suppressed osteogenesis differentiation after irradiation, is one of the main pathological basis of the hematopoietic failure in marrow type acute radiation sickness, but the molecular mechanism is unclear. Our previous researches showed that irradiation induced the high expression of Crif1 and the co-localization with Nrf2 in nuclear of BMMSCs , and the inhibition of Runx2 transcriptional expression. The phosphorylation level of Y568 negative regulating the nuclear stability and the nuclear export of Nrf2. In vitro researches and bioinformatics analysis showed that Crif1 may have possible binding sites near Nrf2 Y568. Thus we speculate that Crif1 could inhibit the phosphorylation level of Nrf2 Y568 to increase the nuclear stability and maintain the transcriptional regulation activation of Runx2, suppress the osteogenetic differentiation of BMMSCs after irradiation. To uncover the mechanism that how Crif1 regulates the nuclear stability and the transcriptional activation of Nrf2, We propose to construct the truncated mutants of Crif1 and Nrf2 to determine the binding sites, and to use siRNA interference and overexpress of Crif1 as well as point mutation induction to research the regulation function of Crif1 for BMMSCs osteogenesis differentiation after irradiation. We hope to clarify the mechanism of the inhibition osteogenetic differentiation of BMMSCs caused by Crif1 after irradiation, to provide a new idea to hematopoietic reconstruction in the treatment of radiation bone marrow syndrome.

辐射抑制BMMSCs成骨分化致其造血支持功能减低，是骨髓型急性放射病造血衰竭的主要病理基础之一，分子机制未完全阐明。本室前期研究发现，辐射诱导BMMSCs高表达Crif1并与Nrf2核内共定位聚集，抑制Runx2转录表达。Nrf2 Y568磷酸化负向调控其核内稳定性、介导出核，而体外实验及生物信息学分析表明，Crif1在Nrf2 Y568附近存在可能的结合位点，由此推测，Crif1可能通过抑制Nrf2 Y568磷酸化并增加其核内稳定性，维持后者对Runx2的转录调控活性，从而抑制BMMSCs辐射后成骨分化。本项目拟通过构建Crif1及Nrf2的点突变体来确定二者的作用位点，再通过干扰和过表达Crif1及点突变诱导，研究Crif1调控Nrf2核内稳定性对BMMSCs辐射后成骨分化的影响，从而阐明Crif1抑制BMMSCs辐射后成骨分化的机制，为骨髓辐射损伤后造血功能恢复提供新思路。

机体短时间内受到1-9 Gy剂量辐射后会引起骨髓型急性放射病（h-ARS），患者可能出现造血功能衰竭而危及生命。骨髓中的造血干细胞（HSCs）对辐射非常敏感，几乎会被放射线全部杀死，然而，HSCs移植并不能显著增加患者的存活率，究其原因，骨髓造血微环境的结构破坏和功能缺失，可能是HSC移植治疗骨髓辐射损伤失败的主要原因。骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是造血微环境的重要组成部分，为HSCs提供必要的支持。目前认为，BMMSCs具有相对较强的辐射抵抗能力，能抵抗对造血干细胞致死剂量的辐射而部分存活，但其造血支持功能则可能受到辐射损伤而减低，已知的表现有成骨成脂定向分化能力失衡。因此，BMMSCs的相对辐射抗性对于h-ARS的救治有非常重要的意义，但其辐射耐受的机制目前尚未完全阐明。.细胞受到辐射损伤时产生的ROS是细胞损伤的直接因素之一，也是其成骨成脂定向分化能力失衡的重要原因。本研究应用体外分离培养人BMMSCs的辐射损伤模型以及Nrf2 -/-敲基因小鼠模型，揭示了CRIF1通过PKC-δ/ NRF2通路调控BMMSCs辐射后氧化应激的重要作用，并进一步探讨了CRIF1调控NRF2信号通路的分子机制。研究结果表明，BMMSCs在辐射损伤后能有效地调节氧化应激，这可能是由于辐射诱导的CRIF1和NRF2蛋白水平升高所致。下调BMMSCs中CRIF1的表达，辐射后细胞的氧化应激程度增加，并加速了细胞的衰老和凋亡。进一步研究表明，CRIF1共激活PKC-δ磷酸化NRF2 Ser40，该位点的磷酸化是NRF2转位入核的关键点，下调CRIF1的表达，将降低细胞辐射后NRF2 Ser40的磷酸化程度，减少NRF2的核转位，从而导致后者介导的抗氧化反应被抑制。集落形成试验进一步证实，辐射BMMSCs的体外造血支持功能干细胞能力受损，而CRIF1的缺乏将加重这种损伤。总之，CRIF1共激活PKC-δ磷酸化NRF2 Ser40，增加NRF2稳定性并转位入核，转录激活下游抗氧化因子，缓解BMMSCs辐射后氧化应激对细胞的损伤，并且可能是维持BMMSCs辐射损伤后造血支持功能的重要因素。