乳杆菌FGM9体外转化黄芪多糖的机理研究

黄芪多糖具有防治病毒病、增强机体免疫力等多种生物学活性作用，市场需求量逐年递增，改善提取率、提高机体内生物利用度具有重要意义。乳杆菌FGM9是分离于鸡肠道的一种野生菌株，经驯化和诱变，发酵黄芪后可使产物中多糖水平显著提高，初步分析多糖增加部分是经FGM9转化而来。本研究拟在前期已建立的体外发酵黄芪转化多糖的技术体系上，用薄层层析法、柱层析法、高效液相和液质联用技术，检测和分析转化产物中多糖的结构，阐述其生化反应机理；采用分子生物学方法和生化鉴定手段，结合多糖结构分析结果，通过对发酵菌种FGM9功能酶基因组学的分析，明确其转化黄芪多糖的关键作用酶；再利用已建立的体外转化模型，分析功能酶、细菌增殖性能、发酵黄芪转化多糖效应三者间的量效关系，明确FGM9发酵黄芪后多糖增加的直接原因，通过综合分析阐述FGM9发酵黄芪转化多糖的机理。旨在为利用分子诱变技术提高菌种转化黄芪多糖的效率提供科学依据。

菌株FGM9是分离于鸡肠道的一种益生菌，前期研究发现黄芪经该菌发酵后多糖提取率有显著升高。为了阐述FGM9发酵黄芪、转化多糖的机理，本项目开展了以下研究，获得的主要进展有：(1)通过FGM9发酵黄芪产物中有效成分离纯化研究，建立了温浸提取-Savage除杂-透析-醇沉-柱层析的发酵黄芪多糖的提取纯化工艺，纯化多糖可达98%；对发酵产物中3种黄芪有效成分的变化分析发现，黄芪经FGM9发酵后多糖含量可提高80%、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量无明显改变、黄芪甲苷降低了50%；推测菌株FGM9具有利用黄芪甲苷合成多糖的可能，毛蕊异黄酮葡萄糖苷可以作为发酵产物定量和定性标示物；发酵前后多糖的单糖组分无显著改变，但发酵后提取的多糖分子量在60～100 kDa的比例显著高于发酵前。（2）通过形态学、生化特性、16S rDNA、系统发育树分析发现，FGM9实属非解乳糖链球菌，并非前期鉴定的乳杆菌，但同为乳酸菌属，不会对机体产生任何毒副作用；正交试验发现，发酵时间为48h、接菌量为5%（2×108个/mL）、黄芪为78%（W/W）、温度39℃、pH值6.4、溶氧量10%、中和剂为6mol/L的NaOH、搅拌转速200r/min时，发酵液中多糖增加量可稳定在1.5倍，其中温度对发酵多糖的变化影响最为显著。（3）采用同源克隆法，从FGM9菌株中克隆到了5种酶标示基因，分别为通透酶、内切葡聚糖酶、α-半乳糖苷酶、UDP-葡萄糖4-异构酶、葡聚-1,6-α-葡萄糖苷酶；实时荧光定量PCR分析显示，这些酶基因在黄芪发酵不同阶段表达量有显著性差异，分析认为α-半乳糖苷酶、UDP-葡萄糖4-异构酶、葡聚-1,6-α-葡萄糖苷酶与黄芪发酵过程中胞外多糖的合成密切相关，黄芪发酵后多糖的增加部分来源于FGM9的代谢转化产物。（4）发酵前后黄芪多糖生物等效性比较研究发现，发酵黄芪多糖具有抑制CCl4导致的大鼠肝纤维化损伤的作用，可促进小鼠骨髓源树突状细胞的成熟和分化，具有增强鸡免疫力和改善饲料利用率的效果。.项目共发表科技论文12篇（SCI收录3篇、一级学报1篇、中文核心8篇），申报国家发明专利2项，相关研究内容获省部级科技奖励2项，培养研究生6名。项目取得的上述阶段性成果为深入开展FGM9生物修饰黄芪有效成分的机理及其代谢组学研究奠定了基础，为研发补益类中药相关成份的发酵提取技术提供了科学依据。