黄芪多糖调控肉鸡大肠杆菌肠炎TLRs信号通路构效机制

肉鸡在短暂的生长周期（42-49 d）内肠道会接触大量致病性抗原，抗生素的限制应用使肠道粘膜条件性致病菌感染更为突出。本项目采用Ussing Chamber和单层细胞培养技术建立体外E. Coli感染模型，经肠道电生理变化、LPS定植特点、肠道免疫指标和抗氧化指标研究黄芪多糖的抗炎作用；利用GC-MS/2D-NMR和化学修饰方法比对分析黄芪多糖与LPS的分子结构和作用的分子靶标，构建大肠杆菌肠炎抗性黄芪多糖与分子靶标的构效关系；采用流式细胞术、荧光定量检测技术研究黄芪多糖调控LPS膜受体（TLRs/MD2/CD14）及其下游信号分子通路的变化规律。旨在阐明黄芪多糖调控肉鸡大肠杆菌肠炎的分子机理，为肉鸡大肠杆菌肠炎抗性多糖的目的性筛选、定向分子修饰及抗生素替代品的开发研究提供理论支撑。

本项目摸索了体外培养Caco2细胞的黄芪多糖的安全浓度范围，并在该范围内进行了黄芪多糖的抗炎浓度试验。添加25, 50, 100, 250, 500和1000 μg/mL APS能够显著促进Caco2细胞的增殖，并且呈现剂量依赖性，表明APS对Caco2没有细胞毒性作用，相反具有生长促进作用。在组织水平，应用Ussing Chamber和单层细胞培养技术建立体外E.Coli炎症模型，并探究了黄芪多糖对炎症条件下的单层细胞生物活性的影响，结果发现，脂多糖刺激能够显著提高单层细胞的膜通透性，提高短路电流Isc值，使细菌等外源微生物更容易通过单层细胞进入肠道内部影响动物健康，黄芪多糖的添加能够缓解脂多糖的影响，并且在预防添加的时候效果最好。在细胞水平，利用荧光定量PCR等技术，通过炎症因子（TNF-α, IL-1β和IL-8）和紧密连接蛋白（ZO-1和occludin）的mRNA表达选取了黄芪多糖的体外最佳抗炎浓度及添加方式，黄芪多糖能够有效的缓解脂多糖刺激引起的Caco2细胞炎症因子的高表达，表明APS对于LPS刺激引起的细胞单层通透性降低具有缓解作用，对肠道上皮完整性具有保护作用。利用800M核磁扫描黄芪多糖C谱、H谱、DEPT谱和Nosey谱，为黄芪多糖的定向修饰奠定了扎实的基础。在确定了APS的结构以及生物活性之后，采用氯磺酸吡啶法对APS进行了硫酸化结构修饰，通过紫外光谱分析和FT-IR扫描证明在其结构的羟基处成功引入了磺酸基，通过体外细胞共同孵育表明低浓度的硫酸化APS（SAPS）对细胞没有毒性，但是当SAPS浓度高于100 μg/mL时对细胞具有毒性作用，随后在SAPS安全浓度范围内对SAPS的生物活性进行了体外评价及机理分析，结果发现SAPS的有效抗炎浓度要低于APS，表明硫酸化修饰提高了APS的抗炎活性。经肉鸡饲养试验，我们发现不同应激状态下APS和SAPA表现出了抗炎活性，其机制涉及到了对免疫效应分子和紧密连接蛋白的调控。本项目取得了一些有特色的创新性成果，为SAPS作为抗生素替代品的的研究发提供了理论基础。发表相关SCI论文9篇，中文核心期刊动物营养学报上发表论文7篇，培养博士研究生2名，硕士生4名，按计划完成了项目预期任务。