基于核糖开关的反义肽肽核酸广谱抗菌靶点发掘及抗多药耐药菌感染研究

Multidrug resistant (MDR) bacterial infections has become a global public health problem seriously jeopardizing human health. Adoption of new strategies for new druggable target discovery and fast validation, thereby developing new broad-spectrum antimicrobial agents is the key solution to bacteria resistance. Riboswitch，mostly located in the non-coding region of mRNA，is a RNA structural element that controls gene expression at transcriptional or translational level upon conformational changes in response to small-molecule ligand binding. Riboswitch plays important roles in bacterial metabolism and signaling. Its highly conserved structure, exclusive substrate recognition and independence in gene expression regulation, make itself an ideal new target for developing broad-spectrum antimicrobial antisense oligonucleotides （ASODNs）. In this project, we aim to screen and validate the specific riboswitch type(s) with potential for broad-spectrum antimicrobial ASODN development and the optimal target site for design and synthesis of peptide conjugated peptide mucleic acid (PPNA), the mode of antimicrobial action (including bacteriocidal effect, virulence inhibition, and restoration of antibiotic susceptibility)and broad-spectrum antimicrobial activity of which will be studied in vitro and vivo. The results will future explore the role of riboswitch in gene regulation, provide reference dada for the development of ribowsitch-based new antibiotic type, and develop new way of combatting MDR bacterial infection.

多药耐药细菌感染疾病已成为严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。采用新策略发现并快速验证新的可药靶点并开发新型广谱抗菌药物是解决细菌耐药性的关键。核糖开关是位于mRNA非编码区的能够与小分子配体结合而引起构象变化从而在转录或翻译水平调控基因表达的RNA结构元件。核糖开关在细菌基本生命代谢和信号传导中发挥重要功能，其高度的保守性、底物专一性及其在调控基因表达中的独立性，使其成为开发广谱反义寡核苷酸类新型抗菌药物的理想新靶点。本项目拟从主要人类致病菌核糖开关数据入手，筛选并验证最具广谱反义抗菌潜力的核糖开关类型及其最优反义靶位，从而开发以其为靶标的具有代表性抗菌模式（即杀菌剂、毒力抑制剂和抗生素增敏剂）和广谱抗多药耐药菌活性的反义肽肽核酸药物。研究结果将利用反义技术更深入的挖掘核糖开关在基因调控中的地位和作用，为基于核糖开关的新型抗生素研制提供数据参考，为多药耐药细菌感染治疗提供新的路径。

核糖开关位于mRNA非编码区，通过变构结合小分子配体在转录或翻译水平调控下游基因表达，具有高度保守性、底物专一性、基因调控独立性和细菌基本生命代谢和信号传导的重要地位。本项目（1）全面搜集细菌、真菌、植物和高等动物的17大类共30种核糖开关数据信息，系统整理、分析获得31种主要人类致病菌中25种核糖开关分布、进化保守性、RNA 二级结构及调控基因功能方式，（2）结合文献，利用 Essential Genes数据库、大肠杆菌全基因组过表达数据库ASKA Library和基于代谢网络预测细菌基因过表达毒性的PanDaTox数据库，对不同类型核糖开关调控基因的敲除和过表达毒性进行注释，最终确定E. coli中AdoCbl和Moco核糖开关作为杀菌模式靶标，S. enterica中ATP sensor开关作为毒力抑制型抗菌模式靶标，（3）利用自主研发软件，针对调控基因具有敲除和过表达毒性的核糖开关的不同关键二级构象形成区域，分别设计 “turn-off”和“turn-on”基因效应型反义肽核酸，与优选(RXR)4XB透膜肽进行共价连接，最终合成13条具有高效递药能力的肽肽核酸（PPNA），（4）通过in vitro抗菌活性评价，筛选出具有良好E. coli杀菌活性的PPNA 2条（MIC AdoCbl-E. coli = 12.5 µM和 MIC Moco-E. coli = 6.25 µM），具有良好S. enterica毒力抑制活性的PPNA 1条（10 µM作用 4h时即可抑制毒力基因mgtC表达水平75%以上，且作用维持至18h）；（5）建立E. coli 侵染人源肠黏膜上皮细胞模型和S. enterica胞内感染巨噬细胞模型，ex vivo评价结果显示Moco核糖开关PPNA在1 µM低浓度即能清除所有胞外菌以保护细胞免受损伤，ATP sensor核糖开关PPNA在0.1 µM低浓度即可抑制毒力基因mgtC表达水平50%以上，且作用维持至8h。本研究在设计 “turn-off”基因效应型反义抗菌PPNA的常规思路上，充分利用核糖开关双向调控基因表达的特征及调控基因的生存必须性和毒性数据，首次设计“turn-on”基因效应型PPNA并实现高效能杀菌活性，研究结果为基于核糖开关的多模式抗菌核酸药物研制提供全新思路和重要数据参考，为多药耐药菌感染治疗提供新靶点。