广谱生防菌X23非核糖体抗菌肽结构及生物合成途径研究

生防菌X23在湖南省连续3年的大田试验中对茄科作物青枯病的防效均高于80%，具有良好的应用前景与开发潜力。它的无菌发酵液具有广谱和高效抑菌活性，前期研究表明，主要活性成份为肽类物质。项目组完成了X23的全基因组测序，生物信息学分析发掘出6个编码非核糖体抗菌肽(nAMPs)合成酶的基因簇。本项目拟综合运用基因敲除、抑菌活性和发酵谱的比较分析，建立nAMPs、合成酶及编码基因簇之间的对应关系；随后分别纯化nAMPs并分析它们的抑菌活性和抑菌谱；最终利用多级质谱从头测序鉴定抑菌活性高且抑菌谱广的nAMPs的结构，并结合基因组学解析其生物合成途径。nAMPs的结构鉴定不但为开发新型抗青枯病的生防制剂提供优良的候选资源，也为通过组合生物学对其进行遗传改良奠定了基础。

比较基因组学分析表明，短短芽孢杆菌菌株X23基因组中至少有12个编码非核糖体肽（nonribosomal peptides,NRPs）、聚酮化合物（polyketides, PKS）和抗菌肽（antimicrobioal peptides, AMPs）类型化合物的基因簇，除了6个编码已知化合物tyrocidine、edeine、bacteriocin、lantipeptide、terpene和petrobactin的基因簇外，另有6个基因簇的功能暂时未被注释。.　　本项目先后利用阳离子交换树脂、亲水色谱法和反相色谱法从广谱生防菌X23发酵液中分离和纯化了2个家族的4个NRPs类抗菌肽，并利用质谱和核磁共振波谱法将其分别鉴定为tyrocidine A/T和edeine A/B。上述两类抗菌肽均具有同时抑制细菌和真菌的广谱活性，但对真菌的最低抑菌浓度高于细菌。.　　项目组利用芽孢杆菌表达载体pAD123-tycA建立了生防菌X23的电激转化体系，在此基础上分别构建了环状和线状同源重组载体用于基因敲除，但未获成功。目前正在开展X23基因组中未知功能的NRPs和PKS类型基因簇的异源表达等工作。已经通过RED/ET同源重组技术构建了异源表达载体p15-cm-X23cluster02，下一步工作是分别转化大肠杆菌和芽孢杆菌，目的是挖掘具有抑菌活性的新次生代谢产物并解析它们的结构与生物合成途径。