刺鼠相关蛋白AgRP在鲈鱼应对植物蛋白替代的摄食调控功能和作用机制研究

Feeding inhibition when fishmeal replaced by plant protein is the main factor for limiting utilization of plant protein in carnivorous species Japanese seabass. Our previous study shown that AgRP rather than NPY is the principal protein molecule that corresponded well to the feeding behavior of Japanese seabass from the anorexia to adaptation stages in Ghrelin/Leptin-mTOR-S6K1-NPY/AgRP/POMC feed intake regulatory pathway of peripheral and central nervous system. However, its regulatory function and mechanism are not clear. In this study, we will focus on the AgRP protein, to research its interacting protein and the mechanism on Japanese seabass appetite regulation during various energy status. We will use Yeast two-hybrid system, Co-Immunoprecipitation, deletion mutant, and gene editing assays, both at in vivo and in vitro levels to investigate the mechanism and function of AgRP and its interacting proteins in feed intake regulation of Japanese seabass. This study will provide scientific basis for solving feeding inhibition after fishmeal replaced by plant protein and promote the breeding of a high plant-protein-tolerance genotype in carnivorous fish.

植物蛋白替代鱼粉后引起鲈鱼等肉食性鱼类产生摄食抑制是限制植物蛋白在肉食性鱼类饲料中有效利用的直接原因。前期研究发现，基于鱼类外周和中枢的Ghrelin/Leptin-mTOR-S6K1-NPY/AgRP/POMC摄食调控通路中，鲈鱼下丘脑神经肽AgRP是鲈鱼在应对植物蛋白替代产生厌食-适应-补偿过程中关键的调控因子，但其具体的调控功能和作用机制尚不明确。本项目拟以AgRP为研究核心，通过蛋白互作来研究AgRP在鲈鱼中如何传导机体信号从而调控摄食行为的。在在体（in vivo）和细胞（in vitro）两个层面，采用酵母双杂交、免疫共沉淀、缺失突变体、基因编辑技术等方法，研究AgRP与其互作蛋白的相互作用在鲈鱼中枢和外周信号通路系统发挥摄食调控作用的分子机理，为解决肉食性鱼类对高植物蛋白产生的厌食抑制问题和定向靶标品种选育提供科学依据。

植物蛋白替代鱼粉后引起鲈鱼等肉食性鱼类产生摄食抑制是限制植物蛋白在肉食性鱼类饲料中有效利用的直接原因。前期研究发现，基于鱼类外周和中枢的Ghrelin/Leptin-mTOR-S6K1-NPY/AgRP/POMC摄食调控通路中，鲈鱼下丘脑神经肽AgRP是鲈鱼在应对植物蛋白替代产生厌食-适应-补偿过程中关键的调控因子，但其具体的调控功能和作用机制尚不明确。本项目拟以AgRP为研究核心，通过蛋白互作来研究AgRP在鲈鱼中如何传导机体信号从而调控摄食行为的。在在体（in vivo）和细胞（in vitro）两个层面，采用酵母双杂交、免疫共沉淀等方法，研究AgRP与其互作蛋白的相互作用在鲈鱼中枢和外周信号通路系统发挥摄食调控作用的分子机理，为解决肉食性鱼类对高植物蛋白产生的厌食抑制问题和定向靶标品种选育提供科学依据。. 本项目通过实验研究，克隆并鉴定了鲈鱼AgRP基因，通过序列分析确定保守区域和关键肽段，并通过免疫荧光实验明确其在鲈鱼组织和细胞中的表达定位；通过酵母双杂交文库筛选，获得鲈鱼中AgRP的相互作用蛋白MC3R、MC4R，克隆鉴定了鲈鱼中MC3R和MC4R全基因，并进一步通过酵母双杂交和免疫共沉淀验证了AgRP与MC3R、MC4R相互作用的真实性。对MC3R和MC4R进行生物信息学序列分析，明确其保守结构域和不同序列区段划分；进一步通过免疫荧光实验确定MC3R、MC4R蛋白在鲈鱼组织和细胞中的表达定位情况；通过细胞实验和鲈鱼养殖实验，明确MC3R和MC4R在鲈鱼应对植物蛋白替代过程中真正行使功能、发挥摄食调控信号传导和调节代谢的分子为MC4R蛋白。根据序列分析结果将MC4R基因序列按照保守结构域分为不同序列区段，通过分子克隆将不同片段构建到对应载体上，确定AgRP与MC4R互作关键区域和关键位点，蛋白发生相互作用的确切氨基酸序列及相互作用关键位点。