协同修复H3K9me3残留和XIST异常表达对牛体细胞核移植胚胎发育的影响

Epigenetic barriers during somatic cell reprogramming hinder the development of somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos, where persistent H3K9me3 residues that are not efficiently reprogrammed and abnormal XCI caused by aberrant XIST expression impede the genome activation and the development of SCNT embryo after implantation, respectively. This project uses male Angus cattle as experimental animal, using the CRISPR/Cas9 editing technology to knock out the XIST gene, and overexpressing KDM4E, H3K9me3 demethylase, by prokaryotic injection technology to obtain SCNT embryos that synergistically repair aberrant XIST expression and H3K9me3 residues. Furthermore, immunofluorescence staining, morphological observation and B-ultrasound are used to detect the development of SCNT embryos in vitro and in recipient cows, and to explore the effects of synergistic restoration of H3K9me3 residues and aberrant XIST expression on bovine SCNT embryo development. The single-cell RNA-seq technique will be used to analyze the differentially expressed genes of the restored SCNT embryos, and the mechanism of H3K9me3 residues and aberrant XIST expression affecting bovine SCNT embryo development, which will provide new ideas and targets for further improving the development of bovine SCNT embryos.

体细胞重编程过程中的表观重编程阻碍限制了体细胞核移植(SCNT)胚胎的发育，其中不完全重编程的H3K9me3残留和XIST异常表达分别阻滞了SCNT胚胎的基因组激活和植入后的发育。本项目以安格斯公牛为研究对象，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除XIST基因，以及通过原核注射技术过表达H3K9me3去甲基化酶KDM4E获得协同修复XIST异常表达和H3K9me3残留的SCNT胚胎，进一步利用免疫荧光染色、形态观察和B超检测修复后SCNT胚胎在体外培养和受体母牛体内的发育情况，探究协同修复H3K9me3残留和XIST异常表达对牛SCNT胚胎发育的影响。应用单细胞RNA-seq技术分析修复后的SCNT胚胎的差异表达基因，初步阐明H3K9me3残留和XIST异常表达阻碍牛SCNT胚胎发育的机制，为进一步提高牛SCNT胚胎的发育提供新的思路和靶点。

XIST是调控哺乳动物X染色体失活的主要基因。在小鼠克隆胚胎中XIST呈异常激活状态，进而影响克隆效率。通过敲除或降低小鼠克隆胚胎中XIST的表达能够显著提高小鼠的克隆效率。另外，研究发现克隆胚胎中H3K9me3重编程不完全。本项目探究协同修复牛克隆胚胎中的H3K9me3残留和XIST异常表达对牛克隆胚胎发育能力的影响。首先，我们通过RNA-FISH、H3K27me3免疫荧光染色和XIST DMR甲基化检测牛IVF和克隆胚胎XIST表达和XCI状态。RNA-FISH结果显示牛囊胚中XIST RNA信号呈“pinpoint”，表达XIST的卵裂球比例较低。H3K27me3免疫荧光染色结果也显示牛囊胚期只有少部分细胞建立了XCI。并且大部分牛囊胚XIST DMR呈低甲基化状态。以上结果表明，牛囊胚中XIST表达和发生XCI的卵裂球比例较低，XCI还未建立，这与小鼠的研究结果不同。牛早期克隆胚胎一些卵裂球XIST呈异常激活状态，但发生异常激活的卵裂球比例较低（小于10%）。其次，针对牛XIST启动子和第一外显子筛选了两个突变效率较高的sgRNA，XP3突变效率为28%，XE2突变效率为31%。XP3和XE2共同作用获得XIST大片段敲除的单细胞克隆，敲除效率为27.1%。QPCR检测结果显示XIST敲除克隆胚胎中XIST被完全沉默。利用建立的CRISPR/Cas9编辑系统制备了雄性樟木牛XIST敲除细胞系和克隆胚胎。之后通过体外转录获得KDM4E mRNA，制备注射KDM4E mRNA的XIST敲除克隆胚胎，并统计了克隆胚胎的体外发育能力。根据目前数据显示XIST敲除胚胎和注射KDM4E mRNA的XIST敲除克隆胚胎的发育率与野生型克隆没有太大差异。综上所述牛囊胚期还未建立XCI，并且牛克隆囊胚中XIST异常激活的卵裂球比例很低，这与小鼠的XCI不同，为牛XCI机制的研究提供理论基础。目前的实验数据显示协同修复牛克隆胚胎中的H3K9me3残留和XIST异常表达对克隆胚胎的发育率没有影响，后续还需进一步研究。