微生物菊粉酶C末端结构域的功能研究

Inulinases are members of glycosidase hydrolase family 32，which comprise a β-propeller N-terminal catalytic domain and a C-terminal β-sandwich domain. They catalyze the hydrolysis of inulin, a plant storage polymer with linear chains of β-(2,1)-linked D-fructofuranose molecules attached to a sucrose moiety at the reducing end. Inulinases can be divided into two exo-inulinases and endo-inulinases according to hydrolysis pattern. Currently, microbial inulinases with high enzyme activity is of particular industrial interest and has received attention as a renewable raw material for biofuel and bio-chemical products production, so they play an increasingly important role in inulin application. But catalysis mechanisms of inulinases are not clear completely. Especially, the function of C-terminal domain is unknown yet. In this study, the N-terminal domain, C-terminal domain and fusion protein from exo-inulinases and endo-inulinases will be expressed, purified and characterized. By analyzing the enzymatic property, the effect of C-terminal domain on inulinase activity and the action of inulin hydrolysis will be studied. Besides, the C-terminal domain CBM function will be examined by the method of differential scanning fluorimetry. The function of microbial inulinases C-terminal domain will be ascertained in this study, and the catalysis mechanisms which focus on the C-terminal domain will be elucidated. These findings will have significance for inulinases rational designing and inulin exploitation.

菊粉酶属于糖苷水解酶GH32家族，由五叶片螺旋桨状的N末端催化结构域和β三明治状的C末端结构域组成，其作用位点为菊粉的β-2,1糖苷键，根据底物水解方式不同分为外切菊粉酶和内切菊粉酶。随着菊粉逐渐成为发酵化工产品和生物能源的重要生物质原料，菊粉酶尤其是高活力的微生物菊粉酶的研究应用日益重要。但其催化机理还不完全清楚，特别是C末端结构域的功能至今未知。本基金项目针对该科学问题，结合最新研究进展和相关工作基础，认为C末端结构域具有重要功能，然后通过缺失、置换结构域的表达策略及酶性质分析、产物层析质朴分析和差示荧光扫描技术等分析手段，研究其对酶活力、酶稳定性、水解底物特异性的影响，并研究其CBM功能，从而全面揭示C末端结构域的功能，并分析其在内切酶和外切酶的功能差异。本项目从C末端结构域功能的角度深入探究菊粉酶的催化机理，为菊粉酶的理性设计和菊芋生物质资源的开发利用提供理论依据和技术支持。

菊粉酶属于糖苷水解酶GH32家族，由五叶片螺旋桨状的N末端催化结构域和β三明治状的C末端结构域组成，根据底物水解方式不同分为外切菊粉酶和内切菊粉酶。近年来，菊粉逐渐成为发酵化工产品和生物能源的潜在生物质原料，菊粉酶的相关研究的研究应用日益重要。本基金项目针对功能未知的菊粉酶C末端结构域展开研究，发现其具有以下功能：（1）C末端结构域对β桶状的N末端结构域有重要的支撑作用，失去或部分C末端氨基酸后，酶活力基本丧失。（2）仅失去C末端结构域最末端的β折叠片Y544-Q556的突变酶仍具有24.8%的活力，但蛋白温度性显著下降，说明C末端结构域同时具有维持整个酶热稳定性的功能。（3）通过C末端结构的表达纯化，发现其虽然没有底物催化能力，但具有菊粉结合能力，并能影响酶的底物特异性。（4）游离C末端结构的添加可以提高菊粉外切酶的活力，推测C末端结构具有一定的底物破坏作用。此外，本项目还探究了究菊粉外切酶和内切酶的协同作用机制，并通过在产油脂酵母共表达菊粉外切酶和内切酶基因来增强菌株利用菊粉产胞内油脂的能力。研究菊粉结合结构域在融合菊粉外切酶催化过程中，通过底物临近效应，提高酶的温度性和一定的底物破坏作用来提高融合酶的催化性能。并利用项目中获得的菊粉酶内切酶基因构建可以高效生产果寡糖的Y. lipolytica工程菌株。本项目从C末端结构域功能的角度重新探究菊粉酶的催化机理，为菊粉酶的理性设计提供理论依据，同时本项目也开展了利用菊粉生产单细胞油脂和益生果寡糖的研究，为菊芋生物质资源的开发利用提供技术支持。