印度芥菜BjHMA4转运蛋白C-末端结构域的位置和功能研究

Transition metals such as Cu, Zn and Mn are essential for plants. Other transition metals such as Cd and Pb are toxic, and even the essential transition metals can be poisonous at elevated levels. In Arabidopsis thaliana, HMA2 and HMA4 are expressed in the vascular system and are important for the translocation of Zn and Cd from roots to shoots. AtHMA4 is predicted to possess a long cytoplasmic domain at the C-terminus that may play regulatory roles. The C-terminal region expressed alone in yeast conferred tolerance to Cd. However, the functional role of the long cytoplasmic C-terminus of plant HMA4 has not been established. To explore the position and function of BjHMA4 transporter C-terminal domain, based on our previous experimental results, we will focus on the substrate specificity and activity rate of various mutant version of BjHMA4 transporting protein by the truncation of the C-terminal sequence and a single base-pair mutation. In particular, the aim was to determine whether C-terminal truncation and mutation of BjHMA4 had any effect on its function in plant and to determine whether the HMA4 mutant versions had potential in future biofortification and phytoremediation strategies.

过渡金属元素如Cu、Zn和Mn对植物来说是必需的，其它的过渡金属元素如Cd和Pb则是有毒的，当在植物体内处于高浓度时，即使是必需的过渡金属元素也是有毒的。在拟南芥中，HMA2和HMA4主要在维管系统表达，在Zn和Cd从根部到地上部分的转运中起重要作用。软件预测结果表明AtHMA4在C-末端有一个长的细胞质中的结构域，该结构域可能具有调节功能。在酵母体内单独表达AtHMA4的游离C-末端能提高酵母的Cd耐受性。然而，植物HMA4的游离长C-末端的生理功能尚不清楚。为了探究BjHMA4转运蛋白C-末端结构域的位置和功能，本项目拟在前期工作基础上，利用C-末端缺失和单碱基突变技术研究印度芥菜BjHMA4 突变体的底物专一性和转运活性。具体来讲，本研究的目标是确定BjHMA4的C-末端缺失和单碱基突变会对其生理功能造成何种影响，并确定BjHMA4突变体在将来用于生物强化和植物修复的可能性。

研究背景：转运蛋白HMA4参与二价重金属（镉、锌、铅和钴）的转运和结合。总体上，作为一个外排泵，HMA4可以提高酵母和大肠杆菌的重金属耐受性。前人的研究表明HMA4的C-末端具有结合重金属的结构域，在酵母中异源表达C-末端的结构域片段能大幅提高酵母的Cd耐受性和富集能力。.结果：我们从印度芥菜中克隆到了BjHMA4基因，qPCR分析表明BjHMA4表达在根、茎和叶中受Zn、Cd诱导上调。在水稻和小麦中过表达BjHMA4显著影响幼苗中的Cd/Zn分布，这些结果表明BjHMA4可能作为外排泵在维管组织中发挥作用。有趣的是，BjHMA4的C-末端包含一个重复区，命名为BjHMA4R，这个重复区离最后一个跨膜区不远。BjHMA4R的同源序列仅存在于十字花科植物中。接下来，通过酵母和大肠杆菌实验研究了BjHMA4R的功能。结果表明：BjHMA4R可以大幅且特异性地提高酵母的Cd耐受性，可在500 μM CdCl2 的培养基上生长，且增强了Cd富集能力（约2倍）。此外，荧光定位实验表明BjHMA4R存在于细胞质中。总体上，在低重金属浓度下，BjHMA4R可以特异性地提高酵母的Cd耐受性和富集能力。大肠杆菌的结果与酵母基本一致。非损伤微检测结果表明在30 μM CdCl2胁迫下，BjHMA4R可以显著改变转BjHMA4R酵母和大肠杆菌的Cd流入流出。总之，如果细胞质中存在低浓度重金属，BjHMA4R可以特异性地结合Cd，因此，实质性地且特异性地提高细胞的Cd耐受性和富集能力。.应用前景：BjHMA4R可以用于微生物法处理含镉废水并且通过生物技术提高植物修复的能力。我们已把BjHMA4R转入拟南芥和水稻中，以确定是否能增强它们的重金属耐受性和富集能力，评价BjHMA4R在环境方面的应用价值。此外，我们还把BjHMA4R转入人的细胞，以确定BjHMA4R是否能像金属硫蛋白那样参与氧化胁迫控制。