HCN通道抑制剂对复苏后心功能障碍的保护作用及相关分子机制研究

The severity of PRMD is closely related to prognosis of CA without effective treatment method. Based on the background and confusion of protection of β-blocker on PRMD， we hypothesize that the molecular expressions of HCN channel are closely associated with pathogenesis and prognosis of PRMD. The rational use of IVA can improve severity of PRMD and prognosis of CA. The protective mechanism of IVA for PRMD includes inhibit energy metabolism disorders and mitochondria-mediated apoptosis by regulating AMPK pathway. This study uses a swine CPR model for inducing CA and PRMD. We investigate the protective effect of IVA on severity of PRMD and prognosis of CA, with detecting the expression levels of HCN channel molecules, index of myocardial energy metabolism, indicators of mitochondria-mediated apoptosis and the expression levels of AMPK pathway molecules. We simulate I/R injury and IVA treatment process by culture system of PRMC in vitro. To explore the molecular mechanism of IVA, we use RNAi technology to downregulating expression of HCN and AMPK genes and detecte the associated changes of molecular expressions of AMPK/PGC-1α pathway, energy metabolism and mitochondrial mediated apoptosis of PRMC. The purpose of this study is to clarify the protective mechanism of HCN channel blocker, and to search for new therapeutic target and drug for PRMD.

PRMD严重度与CA患者预后密切相关，但尚缺乏有效的治疗手段。基于β受体阻滞剂保护PRMD的研究背景和困惑，本课题提出HCN通道蛋白及相关分子与PRMD发病机制和预后相关。合理使用IVA可保护PRMD并改善预后，其分子机制可能与调控AMPK通路，抑制能量代谢失调和线粒体途径细胞凋亡密切相关。本研究拟建立猪CPR模型，观察IVA对PRMD的保护作用，同时检测HCN通道蛋白及相关分子、心肌能量代谢指标、线粒体途径细胞凋亡指标和AMPK通道相关分子的表达水平。建立体外PRMC研究平台，模拟I/R损伤及IVA治疗，利用RNAi技术下调HCN和AMPK基因表达，同时检测IVA对AMPK/PGC-1α 信号通路相关分子表达、细胞能量代谢和细胞凋亡的影响以明确IVA保护PRMD的分子机制。完成本课题可阐明HCN通道阻滞剂对PRMD的保护机制，为PRMD治疗寻找新的干预靶点和药物。

课题在体内实验以家猪作为研究对象，建立了家猪心脏骤停复苏模型，体外实验以大鼠心室肌细胞株（H9c2）为研究对象，建立了缺血再灌注模型。采用组织多普勒超声检测、生物能量检测等技术深入靶向研究伊伐布雷定对于复苏后心功能障碍的作用以及相关的信号通路。实验结果：（1）采用8 min电流刺激诱发室颤加8 min心肺复苏方式建立家猪CA模型稳定, 组织多普勒超声能有效评估复苏后心脏收缩和舒张功能变化。（2）复苏后动物均存在心功能障碍和心肌损伤，主要表现在EF、E/A值降低，E/e′值升高及血清心肌损伤标志物cTnI、NT-proBNP浓度升高。（3）HCN通道抑制剂IVA能够安全有效减慢心率，改善复苏后心脏收缩功能EF值和舒张功能E/A、E/e′值，降低血清心肌损伤标志物cTnI、NT-proBNP浓度，在临床心肺复苏研究中具有潜在的应用前景。（4）心肌细胞缺血再灌注后生物能量代谢紊乱，氧化磷酸化以及糖酵解均有一定的改变。（5）基于AMPK/SIRT1/PGC-1α途径研究IVA对缺血再灌注后心肌能量代谢和氧化应激作用机制，表明IVA通过改善缺血再灌注损伤后心肌细胞的线粒体结构，调节能量代谢，减轻氧化应激，提高细胞活力减少凋亡从而保护心肌细胞。（6）IVA可以增加缺血再灌注损伤后心肌细胞p-AMPKα和PGC-1α能量通路相关的基因和蛋白表达，改善心肌细胞线粒体的超微结构，增加线粒体ATP以及减少ADP和AMP表达，表明伊伐布雷定具有调节能量代谢的作用。（7）IVA可增加缺血心肌SIRT1以及PGC-1α相关线粒体氧化功能基因和蛋白的表达，降低ROS水平，增加细胞内NAD+水平，表明伊伐布雷定具有调节氧化应激的作用。