补肾活血法促一氧化氮生成机制及信号转导路径研究

补肾活血法可升高血清一氧化氮（NO）、雌激素（ER）作用，且升高NO幅度高于ER；对绝经女性心脑血管病防治有积极意义。将其制备成含药血清作用于人脐静脉内皮细胞，观察给予不同药物浓度及经ER阻滞剂、一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂预处理后生成NO及eNOSmRNA表达情况,研究对NO生成经典路径的影响；观察不同给药时间后及经ER阻滞剂、eNOS抑制剂、转录抑制剂预处理后eNOS活力变化，研究其对ER介导的非经典路经的影响；观察含药血清及经ER阻滞剂、丝裂原活化蛋白（MAPK）激酶特异抑制剂预处理后MAPK活性变化，研究其对ER介导的非经典路径中的信号转导途径。阐明该复方促内皮细胞生成NO的机制。

本研究利用新生儿脐静脉成功分离内皮细胞，观察补肾活血方对内皮细胞产生NO的机制研究。我们课题组按照标书计划顺利分离、VIII因子免疫荧光鉴定人脐静脉内皮细胞（HUVEC）阳性，用日本大白兔制备含药血清高中低剂量和阴性对照组，从细胞水平观察补肾活血方对HUVEC细胞分泌NO影响。MTT实验观察含药血清对细胞增殖影响，我们研究表明，24、48、72h与不含药血清对比含药血清浓度时间依赖性促进细胞增殖。通过NO分析，eNOS抑制剂L-NAME抑制HUVEC细胞分泌NO, 雌二醇及不同含药血清提高eNOS抑制剂L-NAME干预的细胞分泌NO。我们进一步分析NO生产的酶eNOS, RT-PCR和western blotting 结果说明含药血清在基因和蛋白水平促进eNOS转录和翻译。我们分析含药血清作用24h内eNOS活力，只有在24h后eNOS活力增加，与mRNA表达趋势一致。我们观察p42/p44通路，抑制剂PD98059抑制细胞p42/p44 磷酸化蛋白表达，但含药血清逆转其抑制作用，促进eNOS表达。我们通过实验研究表明含药血清从eNOS和p42/p44两靶点促进HUVEC细胞分泌NO，并且是在基因水平改变。