SERPINA3K抑制角膜缘微环境功能障碍及其机制研究

角膜缘干细胞缺乏是严重的致盲性眼病，部分是由于角膜缘微环境功能障碍而引起，主要表现为炎症细胞浸润、纤维组织增生及新生血管形成。丝氨酸蛋白酶抑制剂SERPINA3K具有抗炎、抗纤维化及抗新生血管等功能，具有抑制角膜缘微环境功能障碍的可能性。我们研究证实，局部应用高浓度苯扎氯铵可导致角膜缘微环境功能障碍，引起干细胞缺乏的病理表现。本项目以小鼠角膜缘微环境功能障碍模型为研究对象，裂隙灯显微镜观察角膜上皮缺损，基质新生血管及角膜上皮结膜化等，通过动物实验和组织块培养，用免疫荧光染色、Western blot等方法，探讨角膜缘微环境发生细胞凋亡、炎症反应及新生血管等，同时检测Wnt信号通路激活情况；分析局部应用SERPINA3K后，角膜缘微环境和干细胞功能恢复情况及其调控机制。本研究不但有助于阐明角膜缘微环境功能障碍导致干细胞缺乏的发病机制，而且有望为临床上治疗相关疾病提供一种新的手段。

第一部分：高浓度BAC诱导小鼠角膜缘干细胞缺乏动物模型..目的：建立BAC诱导的角膜缘干细胞缺乏小鼠模型。..方法：0-0.5%的BAC滴眼液给小鼠点眼4周，裂隙灯观察角膜新生血管、炎症及角膜上皮状态，在第4周和第12周，取眼表组织进行染色，投射电镜观察角膜缘形态结构，眼表印记细胞进行PAS染色。..结果：0.5%的BAC滴眼液点眼，每天4次，共28天成功诱导了角膜缘干细胞缺乏的表现，包括角膜新生血管，角膜基质炎症，角膜上皮细胞缺失，角膜上皮K19和K13染色阳性。角膜缘P63，ABCG2表达降低。投射电镜显示角膜缘基底膜结构紊乱，细胞不规则。在0.5%的BAC组，BAC点眼28天后，角膜上皮PAS染色阴性，但是BAC撤退8周后，PAS染色阳性，K10染色阳性，而K12染色阴性。..结论：局部应用高浓度的BAC可以诱导小鼠角膜缘干细胞缺乏的临床表现，可以作为研究角膜缘干细胞缺乏病理机制和治疗的基础。...第二部分：SA3K抑制TNF-α诱导的兔角膜内皮细胞屏障功能的破坏..目的：本研究旨在探讨SA3K对TNF-α诱导的兔角膜内皮细胞屏障功能的保护作用。..方法：新西兰大白兔角膜组织块培养，实验分4组：阴性对照组，TNF-α组，TNF-α+低浓度SA3K组，TNF-α+高浓度SA3K组。通过检测角膜内皮对FITC-右旋糖酐的渗透来评价角膜内皮屏障功能。角膜组织铺片免疫荧光方法检测紧密连接蛋白ZO-1、粘着连接蛋白VE-cadherin、纤维肌动蛋白和微管结构蛋白的形态和分布，Western blot分析和RT-PCR检测ZO-1、VE-cadherin、MLC及p-MLC等蛋白表达量的变化。..结果：TNF-α剂量依赖性地诱导角膜内皮对FITC-右旋糖酐的渗透性增加， SA3K抑制TNF-α对角膜内皮屏障功能的破坏。TNF-α诱导ZO-1和VE-cadherin的分布紊乱、F-actin和microtubule的结果破坏，而对ZO-1和VE-cadherin的mRNA和蛋白表达量都没有影响。Western blot分析显示，SA3K抑制TNF-α诱导的p-MLC的增加，而对总MLC的表达量没有影响。..结论：SA3K抑制MLC的激活、维持角膜内皮屏障结构和功能的完整性，减少TNF-α的破坏作用，可能具有重要的临床应用价值。