速激肽及其受体作为长日照信号调节山羊促乳素分泌机理的研究

Tachykinins play an important role in the control of mammal reproductive functions.Seasonally breeding animals such as goat is an ideal animal to establish long-day experimental animal model.In this study, the Race technique would be used to clone the Tachykinins(TKs) and tachykinin receptors(TKR) in goat.Then,the Quantitative real-time by PCR,western blot and immunohistochemistry would be used to test the differential expression of Tachykinins and tachykinin receptors on the hypothalamus, pituitary and ovarian tissue，and to study effects of tachykinins on prolactin secretion in vitro,and to detect the signaling pathway of regulating prolactin-releasing by TKs.This reseach aims to reveal the mechanisms of tachykins as long-day signals inducing seasonal hormone changes and regulating reproduction in goats.The research of TKs and TKRs in genetic breeding of goat offers important new insight into the complex mechanisms controlling pituitary hormone release by timed signals and the internal biological clockwork in this tissue,and provides theoretical basis for further studying of TKs and TKRs in goats genetic breeding and reproduction.

速激肽对哺乳动物繁殖有重要调节作用，山羊的繁殖具有明显的季节性，是建立长日照信号理想的实验动物模型。本研究采用RACE技术克隆速激肽及其受体基因全长cDNA序列；利用qRT-PCR、Western印迹和免疫组化技术分析速激肽及其受体基因在山羊下丘脑垂体、卵巢等组织中的表达情况；测定光照信号刺激对垂体、卵巢等组织中速激肽及其受体基因表达变化和血液中生殖激素的影响和在体外培养条件下速激肽对垂体细胞促乳素分泌能力的影响,研究速激肽基因作用垂体细胞调节促乳素释放的信号通路。通过研究，旨在揭示速激肽及其受体基因作为长日照信号诱导生殖激素释放、调节山羊生殖规律的机理，同时对深入理解人为时钟信号和组织内在时钟信号调控季节性繁殖的哺乳动物垂体激素释放机理提供新的思路，为速激肽及其受体基因在山羊遗传育种和繁殖领域的深入研究提供理论依据。

速激肽(Tachykinins，TKs)属于激肽类家族成员，研究表明，速激肽通过下丘脑神经元影响促性腺激素释放激素（GnRH）的释放，从而影响动物发情、排卵和妊娠等一系列生殖过程。目前认为，有两个主要通路调控哺乳动物繁殖现象，一是松果体分泌褪黑激素直接作用于垂体峡部结节部，调控促甲状腺素，然后促甲状腺激素把信息反馈至下丘脑来调控哺乳动物相应的生殖功能；另外一个通路是垂体通过调节催乳素（PRL）节律性释放来调节哺乳动物的季节性繁殖现象，这个通路中的重要信号物质可能包括速激肽在内的一系列低分子量肽。为了研究速激肽对山羊繁殖机能的影响，本课题开展了速激肽及其受体基因作为长日照信号调节山羊促乳素分泌机理的研究。成功克隆了槐山羊TAC1基因的7个外显子、6个内含子。得到速激肽基因受体TACR1基因的5个外显子、TACR2基因的5个外显子及TACR3基因的cDNA序列。将研究的山羊TAC1基因cDNA全长序列首次向NCBI网站提交，获得序列号MG757439，为后人研究提供方便和参考。通过山羊光控实验，利用转录组测序等技术筛选光照诱导的山羊季节性繁殖相关基因，分析了不同光照条件下差异基因表达情况并对靶基因进行GO功能富集和KEGG Pathway信号通路富集分析。主要发现了不同光照条件下差异表达基因及其与光照模式的关系。随后，利用细胞体外培养、ELISA酶联免疫、荧光定量PCR、免疫组化等技术，研究了不同光照条件下山羊促乳素等激素分泌规律、速激肽及其受体基因对垂体细胞生殖激素尤其是促乳素分泌的影响；测定了速激肽及其受体基因TAC1、TACR1、TACR2和TACR3基因的表达量和垂体分泌PRL水平的变化。主要发现了由短光照转变为长光照时，PRL随着速激肽基因相对表达量的降低而呈下降趋势，初步探明了光照介导师的速激肽及其受体基因对山羊生殖调控或神经内分泌活动的影响，揭示了光照刺激速激肽基因尤其是TAC1基因在各组织中的表达，进一步证实，速激肽及其受体基因表达与促乳素分泌关系密切，速激肽是促乳素分泌的促进因子之一，为进一步阐明速激肽基因调节哺乳动物生殖生理提供理论参考。