速激肽P物质对草鱼促性腺激素合成与分泌的调节作用及其分子机制

Substance P (SP) is the first member of tachykinin family. In mammals, SP is known to be involved in reproductive regulation. However, little is known about the physiological functions of SP in fish. In our recent studies, using grass carp as a model, we found that SP might have a potent role in the regulation of gonadotropin hormone (GtH) synthesis and secretion at the pituitary level. Basing on these results, using grass carp as a model, we will elucidate the in vivo function of SP-regulated gonadotropin hormone synthesis and secretion. Secondly, using several inhibitors and activators, we will unravel the function, receptor specificity and post-receptor signal pathways for the direct regulation of GtH synthesis and secretion by SP in grass carp pituitary cells. Finally, using grass carp hypothalamus cells as model, we will further unveil the indirect regulation of GtH synthesis and secretion by SP-regulated gonadotropin hormone releasing hormone (GnRH) synthesis. Our findings will demonstrate for the first time the functional role of SP in the regulation of reproduction in fish hypothalamus and pituitary, respectively. Furthermore, this study will also provide new ideas for fish reproductive regulation, and give a contribution to the development of novel methods to shorten the age of sexual maturation in fish.

P物质（SP）作为速激肽家族中第一个被发现的神经肽，对哺乳动物的生殖调控具有重要作用；但其在鱼类中的研究才刚起步，具体生理功能尚不清楚。项目组前期研究表明SP可能参与调节草鱼垂体促性腺激素（GtH）的合成与分泌。基于此，本项目拟采用在体方法，检测注射SP后草鱼GtH mRNA表达水平和蛋白分泌水平的变化，明确SP对草鱼体内GtH合成与分泌的影响；采用离体方法，以草鱼垂体原代细胞为对象，对第二信使生成量、通路因子抑制剂阻断SP反应和激活剂模拟SP反应进行分析，揭示SP对草鱼垂体GtH合成与分泌的直接调节作用、调节的受体选择性和受体后信号通路；同时以草鱼下丘脑原代细胞为对象，通过检测SP对下丘脑中GnRH mRNA表达水平的影响，明确其对垂体中GtH表达的间接调节作用。从下丘脑和垂体两个层面，解析SP在草鱼生殖调控中的作用；为阐明鱼类生殖调控机制提供启示，并为缩短鱼类性成熟时间提供理论参考。

大型经济类性成熟时间长的问题普遍存在，这给人工繁殖生产和提高良种选育效率带来较大困难。速激肽是哺乳动物中最大的一个脑肠肽家族，具有广泛的功能。TAC1是该家族中的一员，其编码的P物质（Substance P, SP）和神经激肽A（Neurokinin A, NKA）在哺乳动物的生殖调控过程中扮演重要的角色；而其在鱼类中的研究较少，具体生理功能尚不清楚。以草鱼为研究对象，克隆获得TAC1及其受体NK1R和NK2R，利用液相色谱-质谱分析技术在草鱼下丘脑和垂体中进一步检测到TAC1基因的编码产物（SP&NKA），从蛋白水平进一步验证了鱼类中存在SP和NKA类似肽。此外，配体-受体选择性实验显示NK1R是SP的特异性受体；而NK2R是一个通用型受体，对NKA、NKB和SP表现出类似的亲和力。组织表达分析显示NK1R和NK2R均在草鱼垂体中高表达，暗示TAC1编码产物在鱼类垂体中可能发挥重要功能。离体实验表明：（1）SP和NKA均能诱导草鱼垂体细胞中泌乳素（PRL）和促生长泌乳素（SLα）的合成与分泌；（2）短时间的SP处理（3hr）可以促进垂体细胞中促黄体生成素（LH）分泌，然而24hr处理可以显著抑制LHβ mRNA表达。受体选择性实验表明SP和NKA分别通过激活垂体中NK1R、NK2R和NK3R调节LH、PRL和SLα分泌与合成。受体后信号通路研究表明：SP和NKA通过激活受体后AC/cAMP/PKA、PLC/IP3/PKC和Ca2+/ CaM/CaMK-II等信号通路诱导LH和SLα分泌和合成；而SP对LHβ mRNA表达的抑制作用只通过AC/cAMP/PKA和PLC/IP3/PKC两条通路完成。本研究将丰富我们对鱼类性成熟启动调控网络的认识；为鱼用催熟药的开发提供基础；对提高草鱼及其它大型鱼类育种效率具有重要意义。