磷脂酶D对肝纤维化时肝星状细胞表型转换的调控及机制研究

肝星状细胞（HSC）向肌成纤维细胞转化是肝纤维化发生发展的核心环节，探讨调控HSC激活时多种表型转换的分子机制对抑制其活化、阻断肝纤维化进程至关重要。磷脂酶D(PLD)是跨膜信号转导酶类，参与调控成纤维细胞脂滴形成、细胞迁移、细胞骨架形成。据此我们设想PLD可能是参与HSC表型转换调控的关键分子。预初实验提示PLD抑制剂N-甲基乙醇胺对大鼠肝纤维化形成有抑制作用。在此基础上，拟通过HSC体外细胞学实验和肝纤维化动物模型在体研究，运用过表达质粒转染和SiRNA基因静默技术，联合细胞和分子生物学方法，研究PLD对HSC激活时脂滴演变、细胞迁移、细胞骨架蛋白、胶原合成和细胞因子分泌等的影响及信号转导途径，以新视角探讨调控HSC激活时细胞结构和功能改变的分子机制。本项目可能为抑制HSC激活和阻断肝纤维化进程提供新的策略和靶点，也为下一步合成PLD特异性抑制剂来实现抗肝纤维化化新药开发提供科学依据。

肝星状细胞（HSC）向肌成纤维细胞转化是肝纤维化发生发展的核心环节，探讨调控HSC 激活时多种表型转换的分子机制对抑制其活化、阻断肝纤维化进程至关重要。磷脂酶D(PLD)是跨膜信号转导酶类，参与调控成纤维细胞脂滴形成、细胞迁移、细胞骨架形成。而这些细胞结构和功能的改变恰恰是肝星状细胞向肌成纤维细胞转化过程中最关键性的表型变化。据此我们设想PLD 可能是参与HSC 表型转换调控的关键分子并开展了相关的体内外实验研究。.本课题首先通过动物水平实验发现在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化和二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化动物模型中，模型组肝组织PLD的活性及mRNA和蛋白表达均较对照组上调；PLD的抑制剂N-甲基乙醇胺明显减低大鼠肝组织羟脯氨酸含量、PLD1活性和表达，及TGF-β1、α-SMA、TIMP1、COL1A1 mRNA的表达，改善大鼠肝组织病理学，抑制PLD的表达减轻了肝纤维化的程度。动物水平的研究表明PLD1参与了肝纤维化的发生发展。 .进一步的体外细胞学实验中，我们首先通过原代培养观察到大鼠肝星状细胞自然活化过程中PLD活性逐步上调。随后我们利用大鼠肝星状细胞株HSC-T6细胞研究观察了PLD对肝星状细胞的增殖及活化的影响：在TGF--β1诱导的HSC-T6增殖活化过程中，PLD活性及表达上调，而以PLD抑制剂FIPI、PLD1inhibitor和PLD1 Si-RNA静默技术抑制PLD及PLD1的表达，EdU染色及流式细胞仪检测显示可显著抑制HSC的增殖，荧光定量PCR检测显示可下调α-SMA及Collagen-I mRNA的表达，揭示PLD1有促进肝星状细胞增殖活化效应，抑制PLD1的表达可抑制TGF--β1诱导的HSC-T6的增殖、活化及胶原合成。进一步的信号通路研究提示PLD1对肝星状细胞增殖活化的调控可能是通过mTOR信号通路实现。.本课题以新的视角探讨调控HSC 激活时细胞结构和功能改变的分子机制。我们的研究表明：PLD1参与了肝纤维化进程的调控，这种作用是通过调控肝纤维化形成的核心细胞——肝星状细胞的表型转换而实现；抑制PLD1的表达可成为防治肝纤维化的新的靶点，PLD1特异性抑制剂有可能成为抗肝纤维化的新工具。本项目的研究为抑制HSC 激活和阻断肝纤维化进程提供了新的策略和靶点，也为下一步合成PLD 特异性抑制剂来实现抗肝纤维化化新药开发提供科学依据