甲基孢囊菌科细菌CHL1修复氯嘧磺隆除草剂污染土壤的分子机制及代谢机理

Sulfonylurea herbicides such as chlorimuron-ethyl are very necessary agricultural chemicals in modern agriculture, but also are one of the most important sources caused non-point source pollution in the current and future of agriculture in China. They not only reduced the productions of sensitive succeeding crops due to herbicide poisoning, but also had a serious impact on farmland soil ecosystem. Studies have shown that microbial remediation technology is the best solution to solve the herbicide contamination of farmland. Using high-efficiently chlorimuron-ethyl degrading bacteria CHl1 (a novel member of the family Methylocystaceae) which have been applied to in situ remediation of chlorimuron-ethyl contaminated soil as study object, by microbial genomics, metabolomics and CRISPR gene editing technology, as well as the biological detection methods of herbicide phytotoxicity and LC-MS metabolites analysis, this project hopes to ascertain the key function genes in CHL1 genome which involved in the degradation of chlorimuron-ethyl; to determine the intermediate products and their biological toxicity; to construct the metabolic pathways of bacteria CHL1 for chlorimuron-ethyl, and indicate the key nodes and related genes, finally to clarify the molecular and metabolic mechanisms of bacteria CHL1 in the remediation of chlorimuron-ethyl contaminated soil. The results obtained from this project will provide a deep understanding of microbial molecular and metabolic mechanisms about sulfonylurea herbicides, and enrich the professional knowledge about microbial remediation of pesticide contaminated soils, and then have theoretical significance for further guide to invent new microbial remediation technologies.

氯嘧磺隆等磺酰脲类除草剂是现代农业不可或缺的农用化学品，亦是当前和未来我国农业面源污染的重要来源之一。其在土壤中累积不仅使敏感后茬作物因药害而减产，且对农田土壤生态系统造成严重影响。微生物修复技术是解决除草剂污染的最佳方案。本项目拟以氯嘧磺隆高效降解菌甲基孢囊科新属新种CHL1为研究对象（己用于污染土壤原位修复试验示范），利用微生物基因组学、代谢组学、CRISPR基因编辑等技术，结合药害生物检测和LC-MS等代谢产物分析方法，揭示CHL1修复氯嘧磺隆污染土壤的关键功能基因；确定CHL1降解氯嘧磺隆的中间产物及其生物毒性；建立CHL1代谢氯嘧磺隆途径的基本框架和明确相关基因作用的关键节点；阐明CHL1修复氯嘧磺隆污染土壤的分子机制和代谢机理。研究结果将加深人们对磺酰脲类除草剂微生物代谢机理和分子机制的认识，丰富农药污染土壤微生物修复理论，亦对更有效地创新微生物修复技术具有重要指导意义。

本项目主要研究内容是以氯嘧磺隆高效降解菌甲基孢囊科新属新种(Chenggangzhangella methanolivorans) CHL1为研究对象，利用微生物基因组、转录组、代谢组及基因工程等技术，来阐明CHL1代谢并修复氯嘧磺隆污染土壤的分子机制和代谢机理。通过四年的研究工作，已经建立起相关研究技术体系和平台，创立了针对菌株CHL1的基因组、降解途径及其代谢功能等研究的分析技术方法，并在氯嘧磺隆代谢调控分子机制方面获得部分创新研究成果。项目首先对菌株CHL1的最优培养基、发酵条件及农药检测最佳色谱技术参数等进行了系统研究和优化；建立起基于液质联用（HPLC-MS）和核磁共振（1HNMR）技术的菌株CHL1降解氯嘧磺隆中间产物的分析方法和研究方案，并分别对其进行结构鉴定。据此，初步推测出CHL1代谢氯嘧磺隆的三条基本降解途径框架，其中第三条途径是本项研究首次发现的在CHL1中参与氯嘧磺隆嘧啶环开环降解的新途径；完成了菌株CHL1的全基因组和在氯嘧磺隆胁迫下不同生长时期转录组高通量测序工作，获得全基因组完成图，并就氯嘧磺隆、阿特拉津等污染物降解相关功能基因对全基因组信息进行了深度挖掘，共推测出2756个可能与氯嘧磺隆降解代谢及调控相关的基因，经过分析初步选取其中18个基因，利用λ-Red技术对其进行了敲除和回补实验，证实了羧酸酯酶（pnbA）、亚硫酸盐还原酶（cysJ）、水解酯酶（sulE）、酰胺水解开环酶（atzD）、脲基甲酸酯水解酶（atzF）和谷胱甘肽S转移酶（gst）等六个相关基因参与了CHL1降解氯嘧磺隆的代谢调控；利用基因工程表达技术，对水解酯酶编码基因sulE进行了克隆表达和功能测定；设计并实施了氯嘧磺隆污染土壤修复功能验证实验，发现CHL1除了在实验室水平可高效降解氯嘧磺隆外，对室外土壤中氯嘧磺隆也具有高效的降解能力，并可改善受损土壤微生物群落结构。综上，四年的研究工作基本完成了任务书中的主要研究内容、实现了预期的研究目标。共发表本基金标注论文10篇，培养研究生3名，配合争取国家重点专项1项。