土壤中氯嘧磺隆抑制大豆根瘤菌结瘤和固氮能力的分子机制

氯嘧磺隆是大豆田专性除草剂之一，在我国大豆种植中广泛施用，由于其在土壤中的残效周期长，可对多种土壤微生物产生药害。前期研究发现土壤中的氯嘧磺隆可严重抑制大豆根瘤菌的结瘤和固氮能力。本研究以东北黑土的大豆盆栽实验为模型，以分子生物学手段分析土壤中氯嘧磺隆对大豆根瘤菌结瘤和固氮关键基因转录水平的影响，结合RNA高通量测序技术分析其转录调控的方式，并以三亲本杂交实验对受抑制关键基因的功能进行验证。本研究可在基因水平上解释土壤中氯嘧磺隆抑制大豆根瘤菌结瘤和固氮能力的分子机制，并为构建耐氯嘧磺隆的大豆根瘤菌基因工程菌提供理论依据。

本研究通过室内自然土盆栽的方法，利用传统微生物学与分子生物学手段，研究氯嘧磺隆胁迫下，土壤中根瘤菌种群数量和群落结构，大豆生长情况，根瘤中可培养根瘤菌种群和结构的变化，以及根瘤菌-大豆共生固氮体系的响应；在无菌蛭石盆栽条件下，采用单一菌株回接实验，结合15N同位素稀释法，分析氯嘧磺隆对大豆生长以及慢生型大豆根瘤菌-大豆的共生固氮体系功能的影响，采用反转录Real-time PCR方法分析氯嘧磺隆胁迫下根瘤菌固氮酶基因nifH的mRNA转录丰度的变化，初步探讨了氯嘧磺隆抑制根瘤菌-大豆共生固氮体系的分子机制。.结果显示，氯嘧磺隆对土壤固氮菌微生物数量并无显著影响，但却破坏了固氮菌微生物种群结构。土壤氯嘧磺隆能明显抑制大豆植株生长，而植株叶绿素含量指数并未受到影响。大豆植株总生物量干重随氯嘧磺隆浓度增加而降低。根瘤数随氯嘧磺隆浓度增大而减少，说明氯嘧磺隆抑制了共生固氮体系根瘤组织的形成及发育。.氯嘧磺隆胁迫条件下，从根瘤中分离得到的根瘤菌菌落数量随氯嘧磺隆浓度增高而下降，在500μg/kg高浓度处理组中，只分离到与对照组及100μg/kg处理组属于同一OTU的慢生型大豆根瘤菌，说明慢生型大豆根瘤菌在此胁迫环境中对氯嘧磺隆具有一定的耐受性。体外纯培养氯嘧磺隆胁迫实验表明，氯嘧磺隆对根瘤菌自身生长没有明显影响。.无菌蛭石盆栽慢生型大豆根瘤菌回接实验表明：大豆株高随氯嘧磺隆浓度增大而下降；叶绿素含量随氯嘧磺隆浓度增大而反常增加，这可能是植株针对氯嘧磺隆胁迫导致共生固氮效率下降作出的应激调节。根瘤数随氯嘧磺隆浓度增加而增多，但没有显著性差异，瘤鲜重在氯嘧磺隆胁迫下没有变化，植株在胁迫环境中形成了多而小的根瘤，根瘤平均固氮效率降低。.15N同位素稀释法实验表明：氯嘧磺隆胁迫下，慢生型大豆根瘤菌-大豆共生固氮体系的固氮效率显著降低，说明氯嘧磺隆对共生固氮体系的功能造成了严重的不利影响。反转录Real-time PCR实验结果显示，氯嘧磺隆胁迫抑制了慢生型大豆根瘤菌固氮酶基因nifH的转录丰度。.以上研究结果说明，尽管氯嘧磺隆对纯培养的大豆根瘤菌生长没有显著抑制作用，但土壤中氯嘧磺隆能影响大豆植株的生长及共生固氮体系的形成及发育，严重影响根瘤菌-大豆植株共生固氮体系功能，降低固氮效率；在这个过程中，根瘤菌固氮基因nifH的转录水平下降可能是氯嘧磺隆降低共生固氮效率的分子机制之一。