新发现溶酶体膜蛋白APR3L的功能研究

溶酶体通过不同机制参与经典的依赖Caspase的细胞凋亡作用和不依赖Caspase的自噬性细胞凋亡。APR3是一个可能参与细胞凋亡/自噬的新功能蛋白，该基因有两个剪切异构体，分别为较长的APR3L和较短的APR3S。前期的溶酶体膜蛋白组学研究结果提示APR3L为溶酶体的膜蛋白，其本项目旨在用进一步证实内源性APR3L为溶酶体的膜蛋白以及研究APR3L是如何参与细胞凋亡/自噬这个生物体重要的生命现象。该课题的意义在于深入我们对溶酶体及溶酶体膜蛋白在自噬／凋亡中的作用的理解，为最终理解治疗溶酶体密切相关的神经系统疾病奠定坚实的基础。

APR3为经细胞器蛋白组学发现的候选溶酶体膜蛋白，生物信息学其预测具有单层跨膜结构。自制抗体及购买的商业化抗体显示该蛋白广泛分布于全身多个脏器和组织，在小鼠脾脏、肾脏、肝脏、肺、睾丸、甲状腺、脂肪组织中具有相对高的表达。利用与溶酶体膜标记蛋白LAMP1进行免疫荧光双染色、及溶酶体示踪剂Lyso-Tracker Red双染色等多种方法证实，APR3蛋白定位于溶酶体膜，是一个溶酶体膜蛋白。通过构建APR3的外源性真核表达载体进一步验证了该蛋白的外源性定位，同样定位于溶酶体。构建APR3的沉默载体pLL3.7-shRNA-APR3及过表达载体FUGW-APR3，经测序验证后，转染NIH-3T3细胞。. Annexin V-FITC标记流式细胞检测发现APR3过表达时细胞凋亡增多，差异具有统计学意义，而沉默组则与阴性对照组相比无明显统计学差异。进一步分析发现APR3蛋白对细胞凋亡功能的影响，收集蛋白进行Western Blot检测发现，APR3过表达组凋亡促进蛋白BAX、BAD表达明显上调，同时凋亡发生的关键蛋白Caspase 3剪切激活体Cleaved Caspase 3表达明显升高。采用GENMED Cathepsin B活性荧光定量检测试剂盒检测溶酶体组织蛋白酶B活性，亦发现APR3过表达组Cathepsin B活性显著升高，而沉默APR3组则略有下降，差异无统计学意义。. Western Blot检测同时发现APR3过表达组自噬相关标记蛋白MAP1LC3B、Beclin 1表达上调。电镜检测APR3过表达组，细胞中溶酶体数量明显增多，体积增大，而且细胞中自噬体及自噬溶酶体明显增多，提示APR3参与细胞自噬。. 流式细胞仪碘化丙啶标记细胞进行细胞周期检测，发现APR3过表达时，阻滞于G0/ G1期细胞增多，减低G2/M和S期细胞比例；采用Cell Counting Kit-8检测APR3对细胞增殖毒性的影响，APR3蛋白过表达可以抑制细胞的增殖；Western Blot检测发现APR3过表达时，细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表达下降，提示细胞周期周期阻滞可能与Cyclin D1表达下降相关。。. 本研究证实APR3L是一个重要的参与细胞凋亡和自噬的溶酶体膜蛋白。. 发表标注SCI文章3篇，中文1篇。待毕业博士研究生1名。