黑木耳多糖模拟水解物的体内分布规律及其抑制线粒体依赖途径的胰岛beta细胞凋亡的分子机制研究

Mitochondrial function injury and the free radical scavenging system function abate are the one of the main mechanisms to induce insulin resistance and the pancreatic β-cell apoptosis, and then to make headway type 2 diabetes mellitus. Four sorts of A. auricular polysaccharide were separated and their molecular structures were speculated, and the hypoglycemic pathway of this polysaccharide closely associated with elimination of reactive oxygen species on the basis of the prevenient research, meanwhile, this polysaccharide active fragment through a gastric motility model designed by Leeds university was gained. In the present study, we therefore, plan to investigate their information of molecular structure, the oral absorption pathway and exclusion rule, and the surface recognition of target molecules in islet cell of this polysaccharide, and then to investigate the relevance of the hypoglycemia activity to its antioxidant activity by using rat pancreas tissue as the working model. We shall also evaluate the gene expression of Bcl-2/Bax, the expression of PI3-K in mRNA, the disruption of mitochondrial membrane potential, the repairing of DNA fragmentation, release of cytochrome c from mitochondria to cytosol, activation of caspases and PARP cleavage in the pancreatic tissue of the experimental rats to address the protective mechanism of this polysaccharide. The structure-activity relationship will be explored further. The results of this study, therefore, might shed some light on the reveal the role of natural polysaccharide in the development of type 2 diabetes mellitus.

线粒体功能损伤及机体清除自由基系统功能减弱是诱发胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能衰竭，进展为糖尿病的主要机制之一。本项目在前期已纯化并鉴定出4种黑木耳多糖分子结构，发现其降糖途径极有可能与其清除活性氧密切相关，并通过体外胃蠕动模型的建立获得了多糖活性片段的基础上，进一步采用荧光标记获得活性片段的稳定性荧光衍生物，并探明其分子结构信息、口服吸收途径与排除规律及其在胰岛细胞表面识别的靶分子，进而通过其调控胰岛细胞PI3-K mRNA及Bax/Bcl-2的表达，对ATP敏感性钾通道kir6.2 mRNA的表达，对线粒体膜电位、caspase家族等胰岛β细胞凋亡依赖途径的研究以及其改善氧化应激损伤抑制线粒体依赖途径的胰岛细胞凋亡与降糖间相关性的研究阐明其降糖的分子机制，并进一步比对解读其构效关系。本项目对揭示天然多糖防治糖尿病的作用机制以及改善目前糖尿病临床用药存在较大毒副作用的治疗现状意义重大。

线粒体功能损伤及机体清除自由基系统功能减弱是诱发胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能衰竭，进展为T2DM的主要机制之一；从调节线粒体功能损伤及增强清除自由基系统功能入手，寻找降低线粒体氧化应激，恢复胰岛β细胞正常功能，是开发新型降糖药物的重要思路。黑木耳是我国珍贵的食药用胶质真菌，近年发现其多糖具有明显的抗氧化活性及降糖作用，我们的研究主要从以下几方面入手并获得如下结果：① 鉴于黑木耳品种及其多糖的制备方法对其生物活性影响极大，我们首先以α-葡萄糖苷酶抑制率、体外自由基清除率及秀丽隐杆线虫体内抗氧化应激指标，筛选获得了高活性黑木耳多糖，进而通过体外胃蠕动模型得到黑木耳多糖模拟水解物（AAOS）。② AAOS能使T2DM大鼠血糖显著降低，血清中的抗氧化物酶CAT、GR及GSH水平显著增加，血清T-CHO与LDL-C水平显著降低，肝糖原含量显著增加，大鼠胰组织中Bcl-2/Bax比值显著升高；同时，AAOS对促进受损的GLP-1分泌有一定效果。结合AAOS能延长高糖环境下的线虫寿命、清除活性氧（ROS）以及对转基因β细胞荧光斑马鱼β细胞再生与糖代谢相关gcgb基因与pka基因的表达有显著促进作用，可以推测，AAOS对调节糖脂代谢，促进内源性GLP-1分泌、减缓氧化应激损伤具有显著效果。③ AAOS经凝胶柱层析纯化后得到5种不同组分，其中AAOS-1抗H2O2诱导的线虫抗氧化应激能力最强；对其进行荧光标记，获得AAOS-1-Tyr-FITC，追踪其在小鼠体内24h的动态分布规律，结果灌胃30min后胃中达到高峰，而后迅速排空，3h后进入盲肠与结肠并不断升高，在大肠存留达18h以上，这为肠道菌群作用提供了充足时间；同时30%左右AAOS-1可进入各组织器官，且存留时间持续24h。AAOS-1分子量为320.6 kDa，分子中主键为β-1→4糖苷键，存在C-1的β-Glc(1→4)-及α-xyl(1→3)-糖苷键，C-6位连有分支侧链，且可能存在脱氧糖的甲基。研究针对T2DM临床用药毒副作用大的治疗现状，对揭示天然多糖防治T2DM的作用机制以及改变目前T2DM临床用药存在较大毒副作用的治疗现状提供了参考。