D型、环化结构支持的高稳定牛乳铁蛋白肽分子设计、抗菌活性及作用机理

A series of LfcinB derivatives with high anti-proteolysis ability and antimicrobial activity will be designed based on D-amino acid substation and cycled peptide chain to control livestock and poultry bacterial diseases, which will focus on the following three aspects: 1) design of the D-LfcinB derivatives by D-amino acids substitution at suitable sites and evaluation of anti-protease degradation ability and bactericidal activity against E. coli and S. aureus; 2) elucidation of anti-protease degradation and anti-bacterial properties of cyclo-LfcinB; 3) explanation of the primary mechanism of D-LfcinB and cyclo-LfcinB with low bacterial resistance, including their interactions with cell membrane and intracellular biological macromolecules. This will provide a new idea for the design and development of bioactive antimicrobial peptides with effective proteolytic enzyme stability to prevent bacterial infections in livestock and poultry.

本项目在课题组广谱性抗菌肽LfcinB前期研究工作基础上，应用细胞学、分子生物学技术从细胞、分子水平研究经D型氨基酸修饰的LfcinB（D-LfcinB）和环化改造的LfcinB（cyclo-LfcinB）杀灭畜禽细菌性致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌、抵御体内蛋白酶降解及杀菌机理，研究内容如下：1）引入“非天然氨基酸”对关键位点进行修饰替换、设计高稳、高活“D-LfcinB”，并明确其对畜禽致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的高效杀菌和高抗蛋白酶解的性能；2）确定“cyclo-LfcinB”对畜禽致病菌G－、G+具有生物活性高、动物体内抗酶解能力强、毒副作用小及耐药性低等特性；3）初步阐明“D-LfcinB”和“cyclo-LfcinB”对畜禽致病菌细胞膜、对胞内大分子的作用机理。这为设计新型抗酶解的抗菌肽提供了重要的理论依据。

长期采用饲料抗生素应对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染引起的畜禽问题，导致病原菌耐药性日益严重。本项目广谱性抗菌肽LfcinB研究前期工作基础上，研究经D型氨基酸修饰的LfcinB和环化改造的LfcinB杀灭畜禽细菌性致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌、抵御体内蛋白酶降解及杀菌机理，研究内容如下：1）引入“非天然氨基酸”对优势位点进行修饰替换、设计高稳、高活“D-LfcinB”，并明确其对畜禽致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的高效杀菌和高抗蛋白酶解的性能；2）确定“cyclo-LfcinB”对畜禽致病菌G－、G+具有生物活性高、动物体内抗酶解能力强、毒副作用小及耐药性低等特性；3）初步阐明“D-LfcinB”和“cyclo-LfcinB”对畜禽致病菌细胞膜、对胞内大分子的作用机理。. 与母体肽相比，D-Lfcin5的抗菌活性增强（MIC：4-8μg/ml），C-Lfcin5对S. aureus的活性增强MIC为8μg/ml。Lfcin5衍生肽低溶血性，但高浓度时有一定的细胞毒性(60%, 128 μg/ml)。温度、PH的变化对其抗菌活性没有影响，仅D-Lfcin5耐胰蛋白酶，血清使得衍生肽的活性降低。杀菌动力学曲线结果表明，2 × MIC的衍生肽在2 h内能够全部杀死E. coli CVCC1515和S. aureus ATCC43300，衍生肽的杀菌能力成浓度依赖性。. NPN染色表明衍生肽在1min内快速穿透E. coli的外膜，且流式细胞仪检测其也穿透细菌内膜（2h时cyclic Lfcin5 (81.9%)> D-Lfcin5 (46.3%)> Lfcin5 (35.2%)）。扫描电镜显示衍生肽引起细菌形态的破坏，如皱缩、孔洞、表皮剥落。凝胶阻滞和圆二色谱表明衍生肽与细菌DNA结合，引起其构象的改变。. 体内实验表明Lfcin5衍生肽对感染小鼠具有保护作用。以上结果为设计新型抗酶解的抗菌肽提供了重要的理论依据，将促进饲料抗生素的减量使用。.