基于血管新生miR-125b-PIGF/Flt1通路探讨清热活血法治疗活动期类风湿关节炎的分子免疫机制

Qingre Huoxue Decoction(QRHXD) was first created by the great doctor Lu Zhizheng to treat RA. It has been applied in clinic times by times and its extraordinary effect has been proved. The passed research showed that QRHXD can prevent bone damage by inhibiting the inflammatory factors and regulating the "bone immunity". In addition, the angiogenesis was obviously inhibited in the experiments, which phenomenon can help relieve the pain and swollen of joints; also it plays an important role in preventing bone erosion. However the specific molecular mechanism remains to be further mining. The latest oncology research suggests PIGF/Flt1 pathway mediated by miR-125b is the key to the angiogenic signaling pathways. To explore the molecular immune mechanism of that QRHXD inhibit inflammatory factors expression and angiogenesis in RA active phase, the study taking the CIA rats and zebrafish angiogenesis model, adopting miR-125b-PIGF/Flt1 pathway as the breakthrough point, using functional genomics technologies such as QuantiGene2.0?、RT-PCR and Western blotting, combining experiments in vivo and in vitro, is of great significance to inherit the experience of well-known TCM doctors, to further reveal its scientific connotation in treating RA.

清热活血方是名医路志正治疗活动期RA的经验方，临床应用多年，效果显著。前期研究表明，其抗骨破坏作用是通过抑制炎性因子表达、调节"骨免疫"实现的，而实验中发现RA血管新生现象受到明确抑制，这在减轻关节肿痛、延缓骨侵蚀方面发挥重要作用，具体分子机制有待深入挖掘。最新肿瘤学研究提示miR-125b介导的PIGF/Flt1通路是血管新生的关键信号传导途径，根据前期工作基础推测清热活血方疗效是通过调控此通路实现的。本研究拟通过CIA大鼠及斑马鱼血管新生模型，以miR-125b-PIGF/Flt1通路为切入点，应用QuantiGene2.0?、RT-PCR、Western blotting等功能基因组学和蛋白组学技术，体内外实验相结合，探讨清热活血方抑制活动期RA炎性因子的表达和血管新生的分子免疫机制，对传承、挖掘名老中医经验，进一步揭示其理论的科学内涵具有重要意义，为临床治疗RA提供新思路。

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以滑膜慢性炎症为主的全身性自身免疫疾病，多种炎症细胞的浸润、血管翳形成和滑膜增生是其基本病理特点，最终导致软骨与骨的破坏。我院以清热活血法治疗活动期（性）RA的临床与基础研究有多年工作积累。最新研究进展指出：信号传导通路——miR-125b-PIGF/Flt1通路在滑膜细胞增殖和血管新生中起重要作用,与RA病情进展密切相关。因此，在前期研究基础上，本课题以血管新生为切入点，对清热活血法在活动期RA调控中的分子免疫机制进行进一步研究。.在本课题中，我们建立CIA大鼠模型,予清热活血方治疗,观察大鼠关节发病率、症状和肿胀度，观察滑膜病理改变和微血管的形成，检测血清中炎症因子和血管新生相关因子的含量，以及miR-125b-PIGF/Flt1信号通路关键分子的表达。取RA患者滑膜组织进行RA-FLS的原代分离培养，用TNF-α诱导维持其病理状态，予清热活血方干预，观察RA-FLS的增殖活性，检测培养上清中炎症因子和血管新生相关因子的含量,以及miR-125b-PIGF/Flt1信号转导通路蛋白水平的表达。建立斑马鱼血管新生模型，清热活血方含药血清干预，计数体节间血管数目(ISV)；检测miR-125b、PIGF、Flt1、Flk1的基因表达水平。按时分阶段完成预期的实验内容，并对数据进行统计分析，得出相应的结论，较好的完成该课题的研究。.结果：（1）体内实验：清热活血方可下调TNF-α，TGF-β，IL-1，IL-6炎性因子水平和VEGF，MMP-1、2、9，bFGF等血管新生因子蛋白表达水平，并下调miR-125b、PIGF、Flt1、Flk1的基因表达水平；（2）体外实验：清热活血方可抑制TNF-α诱导的RA-FLS的增殖、迁移和对FN黏附的作用，并降低促炎因子VEGF，PLGF,IL-1β含量，协同抑制VEGF诱导HUVEC增殖、迁移、黏附及管腔形成，并降低Flt1、Flk1的含量;（3）斑马鱼实验：不同浓度清热活血方可不同程度抑制血管新生状况。.本项目研究表明清热活血法通过调控miR-125b-PIGF/Flt1信号通路，抑制RA滑膜成纤维细胞、抑制炎症反应，进而抑制血管新生。阐释了清热活血法治疗RA的科学内涵，验证了假说的客观性,为不断丰富和完善名老中医经验治疗RA的中医理论具有重要意义。